SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3683—2013 松针褐枯病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Mycosphaerella gibsonii H. C. Evans 行业标准信息服务平台 2013-08-30发布 2014-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3683—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 局、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：姚剑、纪睿、廖太林、张萍、陈雪娇、李云飞、李刚、王振华、李百胜。 行业标准信息服务平台 SN/T3683—2013 松针褐枯病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了进出境植物检疫中松针褐枯病菌MycosphaerellagibsoniiH.C.Evans的检疫鉴定 方法。 本标准适用于来自松针褐枯病菌疫区的寄主植物苗木、切枝以及松针的检疫。 2松针褐枯病菌基本信息 学名：MycosphaerellagibsoniiH.C.Evans1984 异名:Cercospora pini-densiflorae Hori &Nambu,Cercoseptoria pini-densiflorae （Hori &.Nam bu) Deighton 英文名：Brownneedleblightofpine,cercosporapineblight 分类地位：松针褐枯病菌有性阶段为子囊菌门（Ascomycota），座囊菌纲（Dothidemycetes），球腔菌 科（Mycosphaerellaceae），球腔菌属（Mycosphaerella）；其无性阶段为Pseudocercosporapini densiflorae (Hori&Nambu)Deighton 1987。 传播途径：松针褐枯病菌通过风、雨水作近距离传播，随带菌苗木、切枝的调运作远距离传播。 松针褐枯病菌的其他相关信息参见附录A。 3方法原理 本方法遵循以松针褐枯病菌的形态特征为主，为害症状、寄主及地理分布为辅的鉴定原则。 4仪器和用具 4.1仪器 显微镜，超净工作台，电子天平，光照培养箱，高压灭菌锅。 4.2用具 培养皿、烧杯、三角瓶、镊子、剪刀、移植环、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯、 5i 试剂、材料和培养基 5.1试剂和材料 V8汁、葡萄糖、琼脂、无菌水、75%酒精、马铃薯、松针。 5.2培养基 V8汁加松针煎汁培养基（P-V）、马铃薯葡萄糖培养基（PDA)，培养基配方见附录B。 1 SN/T3683—2013 6鉴定方法 6.1症状检查 检查幼苗针叶是否环死、脱落，是否有浅绿色、黄褐色至灰色的病斑，观察病斑上有无黑点。将疑似 感病样品带回实验室作进一步检验。 6.2切片检验 选取疑似感病样品，用剪刀剪取针叶组织（长约5mm），切片，从中选择片薄而带有黑点部分的切 片，用移植环移于载玻片中央的水滴中，在显微镜下观察子座、分生孢子梗以及分生孢子特征。如针叶 病斑无子实体或子实体未成熟，可将感病针叶在25℃～30℃条件下保湿培养，待子实体长出并成熟后 再做切片镜检。时间约需20d。 6.3分离培养 在典型病斑中切取小块病组织，在75%酒精中浸30S，用无菌水冲洗3次后置于P-V培养基上， 25℃光照培养12h与0℃～10℃黑暗培养12h交替进行。经纯化培养后，观察菌落生长性状，12d 后镜检。 7鉴定特征 7.1无性阶段 分生孢子梗密集，丛生，暗褐色，直或稍弯，极少分隔，不分枝；大小2.5um×（10um～45um）。分 生孢子产生部位不加厚，无疤痕而具细点。分生孢子单生，淡黄褐色，长棍棒形，直或微弯，3～7分隔， 基部平截或圆，不加厚，顶端钝圆：大小（20μm～60μm）×（2.5μm~4.5μm），大多数为（40μm~ 50 μm)X(2.5 μm~4.5μm)。 7.2有性阶段 子座暗褐色，具疣状突起，充满气孔空隙，直径60um～96μm。子囊双囊壁，棍棒形至圆筒形， （33μm~38μm）×（5.5μm~7μm）；具加厚的钝圆的顶端极少具气囊；（32μm~36μm）×（6μm~ 8μm）；8个孢子，排成倾斜两列。子囊间组织有或无。子囊孢子无色，1个分隔，椭圆形至楔形； 首(r8z~r8X(rsz~r9) 7.3松针褐枯病菌与同属近似种区别 松针褐枯病菌与近似种松针褐斑病菌MycosphaerelladearnessiiBarr及松针红斑病菌Myco sphaerellapiniE.Rostrup的区别参见附录C。 8结果判定 如样品的切片和（或）分离培养的病菌形态特征与7.1和（或）7.2相符，即鉴定为松针褐枯病菌。 9样品、菌种保藏 分离菌转接在P-V培养基斜面上，待斜面表面长满菌丝后，置于4℃保存，定期转接。有条件可进 行冷冻干燥保存。检出病菌的样品妥善保存6个月，保存期满灭活处理。 2