SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3557—2013 黄热病毒RT-PCR和实时荧光 RT-PCR检测方法 RT-PCR and real time RT-PCR detection methods of yellow fever virus 行业标准信息服务平台 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3557—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：师永霞、洪烨、丁国允、相大鹏、孙薇、李小波、郑夔、黄吉城、幸芦琴、郭波旋、 钟玉清、李燕。 行业标准信息服务平台 SN/T3557—2013 黄热病毒RT-PCR和实时荧光 RT-PCR检测方法 1 范围 本标准规定了国境口岸黄热病检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，黄热病 毒常规RT-PCR检测和实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于国境口岸人出境人员或媒介蚊虫携带黄热病毒的分子生物学检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 人间传染的病原微生物名录（卫生部） 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 RT-PCR：反转录-聚合酶链反应 实时荧光RT-PCR：实时荧光反转录-聚合酶链反应 Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阅值时所经历的循环数 RNA：核糖核酸 FAM：FAM荧光染料，一种荧光报告基团 4术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 4. 1 黄热病yellowfever 由黄病毒科、黄病毒属的黄热病毒（yellowfevervirus；YFV）引起的急性传染病，埃及伊蚊（Aedes aegypti）是主要的传播媒介，主要流行于非洲和中、南美洲，3月份～4月份的病例较多。临床特征有发 热、剧烈头痛、黄疽、出血和蛋白尿等。 4. 2 黄热病毒yellowfevervirus 有刺突。病毒基因组为单股正链RNA，相对分子质量约为3.8×10°，长约11kb。 5生物安全要求 1 SN/T 3557—2013 一黄热病毒相关的病毒培养和动物感染实验操作应在生物安全Ⅲ级（BSL-3或ABSL-3）实验室 内进行； 黄热病毒相关的未经培养的感染性材料的操作应在生物安全IⅡ级（BSL-2)实验室内进行； 一 黄热病毒的病毒培养物运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。 6标本的采集、运输和保存 6.1人血清 无菌采集疑似病例发病3天内静脉血3mL~5mL，室温静置30min使其凝固，500g离心10min， 收集血清于2mL无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验室检测。如24h内 不能送到实验室，将血清置于一70℃保存。 6.2蚊虫 采集吸过血的伊蚁或其他可疑媒介蚊城市型黄热病的主要传播媒介为埃及伊蚊，丛林型黄热病的 传播媒介主要有趋血蚊属（Hemagogus）和煞蚊属（Sabethes）」，用10%葡萄糖液喂养蚊虫至胃血完全 消化后，按蚊种及捕获地点分组装至有螺旋帽的无菌管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温运输或 一70℃以下保存待检 7标本的处理 7.1血清标本 血清标本直接进行分子生物学核酸的提取，如24h内不能及时检测应存放在一70℃冰箱。 7.2蚊虫标本 7.2.1在冰上操作。从一70℃容器中取出蚊虫标本，倒入研磨器中。 7.2.2加入1mLHanks液吹洗，弃去液体后加人1mL标本处理液（配方参见附录A），反复研磨至组 织碎片基本消失。 信息服务平台 7.2.3将研磨液吸入1.5mL离心管，配平后置预冷4℃的离心机上，20000g离心10min。 7.2.4取上清液进行分子生物学核酸的提取。 8黄热病毒的RT-PCR检测 8.1主要仪器 本方法使用的主要仪器如下： PCR扩增仪； 千分之一天平； 超净工作台； ⅡIA级生物安全柜； 一 高压灭菌锅； 低温高速离心机：最大离心力20000g； 一电泳仪； 凝胶成像分析系统； 2