SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3496—2013 动物源性饲料中转基因成分实时荧光 PCR检测方法 Protocol of the real-time PCR for detecting genetically modified component in animal-originated-feedstuffs 行业标准信息服务平台 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3496—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局、中华人民共 和国深圳出人境检验检疫局、中国农业大学、北京市畜牧兽医总站。 本标准主要起草人：刘建、林祥梅、朱振营、张永宁、王建武、吴绍强、郑海松、凌杏园、薛振华、张曼、 于宁、王彩霞、李志辉、景宏丽。 行业标准信息服务平台 I SN/T 3496—2013 动物源性饲料中转基因成分实时荧光 PCR检测方法 1范围 本标准规定了动物源性饲料中转基因成分的实时荧光PCR检验方法。 本标准适用于猪、牛、羊动物源性饲料中转基因成分实时荧光PCR检验。 2# 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3纟 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 β2m:β2微球蛋白(β2-microglobulin) bp：碱基对（basepair） CMV：巨细胞病毒（cytomegalovirus） Ct：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（cyclethreshold） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycyticinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate) dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate) DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid）。 GFP：绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein） 服务平台 NPTIⅡ：新霉素-3'-磷酸转移酶基因（neomycin-3'-phosphotransferasegene) PCR：聚合酶链反应（polymerasechainreaction） SV40：猿猴空泡病毒40（SimianVacuolatingvirus40) Tag酶:DNA聚合酶 TE:Tris-HCl,EDTA缓冲液 Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethane） 4 实验方法 4.1主要仪器 4.1.1实时荧光定量PCR仪。 4.1.2超净工作台。 4.1.3 消毒灭菌锅。 4.1.4旋涡振荡器。 1 SN/T 3496—2013 4.1.5 高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机。 4.1.6低温冰箱。 4.1.7纯水器，双蒸水器。 4. 2 主要试剂 除另有规定外，所有试剂均采用分析纯或生化试剂。 4.2.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。 4.2.2 PCR缓冲液。 4.2.3氯化镁（MgCl2）。 4.2.4dNTPs(dATP、dTTP,dCTP,dGTP)。 4.2.5 4.2.6其他药品及试剂配制方法见附录A。 4.3 引物和探针 按照表1中提供的引物及探针序列合成引物及探针（参见附录B），加人无离子水配成100pmol/L贮 存，配成直接用于PCR反应的10pmol/μL的工作液。 表1 检测转基因动物内、外源基因所需的引物及探针序列 被检测基因 基因来源 引物序列 探针序列 备注 5'-CTGCTATGTGTATGGGTTCC-3 5'-AGACAGGTCTGACTG 牛β2m 牛内源 内参照 5'-GTAGAAAGACCAGTCCTTGC-3" CTCCGATTTAATC-3' 5′-GAAGGTTCAGGTTTACTCACG-3' 5′-CCCAGCGGAAAACGG 猪β2m 猪内源 内参照 5'-TCAGCAAATCAATTTCAATCTGG-3' AAAGCCAA-3' 5'-TTTCGCCTTTCACTTTATTTTCCC-3' 5′-CGCAGCCCTCGCCAT 羊线粒体基因 羊内源 内参照 5'-GGGTTGTTGGATCCTGTTTCG-3' AGTTCACCT-3' 5′-TCACAAATTTCACAAATAAAGC-3′ 5′-CACTGCATTCTAGTTG SV40 polyA 外源 筛查检测 5'-ACATGATAAGATACATTGATGAG3' TGGTTTGTCC-3' 5°-TATGACTGGGCACAACAGAC-3， 5′-CTGCTCTGATGCCGCC NPT II 外源 筛查检测 5'-CGTCTTGCAGTTCATTCAGG-3' GTGTTCC 3' 5′-GTTCCGCGTTACATAACTTACGG-3" 5′-CCGCCTGGCTGACCG CMV启动子 外源 筛查检测 5'-AAGTCCCTATTGGCGTTACTATGG-3'CCCAAC-3' 5'-AACCGCATCGAGCTGAAG-3' 5'-ACCTTGATGCCGTTCT GFP 外源 筛查检测 5'-GTTGTGGCGGATCTTGAAG-3' TCTGCTTGTCG-3' 4.4 实验步骤 4.4.1 DNA提取与纯化 DNA提取与纯化按以下步骤操作： a) 取动物源性饲料0.1g，液氮研磨后转入1.5mL离心管中，加入1mL的组织裂解缓冲液，加 2