SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3494—2013 动物及其加工产品中转基因成分 PCR筛查方法 Protocol of the PCR method for screening genetically modified component in animals and their derived products 行业标准信息服务平台 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3494—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局、中国农业大 学、中华人民共和国海南出入境检验检疫局、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：刘建、林祥梅、朱振营、吕继洲、李丹丹、郑海松、王建武、韩雪清、梅琳、邓俊花、 仇松寅、王建峰。 行业标准信息服务平台 SN/T3494—2013 动物及其加工产品中转基因成分 PCR筛查方法 1范围 本标准规定了动物及其加工产品中转基因成分PCR检测方法。 本标准适用于动物及其加工产品中转基因成分筛查检测。 2夫 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20190 饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链反应（PCR）法 GB/T 21101 动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 转基因 transgene 将本物种不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过各种导入手段，使其在该物种中进行 标准信息服务平台 表达，以便使该物种获得新的品种特征。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp碱基对（basepair）。 CMV启动子：人巨细胞病毒（humancytomegaloviruspromot dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）。 dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycyticinetriphosphate）。 dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）。 dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）。 dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）。 GFP：绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein）。 SV40：猿猴空泡病毒40（SimianVacuolatingvirus40）。 Taq酶:DNA聚合酶。 TE:Tris-HCI、EDTA缓冲液。 1 SN/T 3494—2013 Tris：三（羟甲基）氨基甲烷【tris（hydroxymethyl)aminomethane]。 5试剂 5.1PCR用引物 内参照基因引物设计参照GB/T20190和GB/T21101，外源基因引物设计见表1（序列参见附 录A，相关文献参见附录B）。将合成的引物加人无离子水配成100pmol/uL贮存，配成直接用于PCR 反应的10pmol/μL的工作液。 表1林 检测转基因动物内外基因所需的引物序列 被检测基因 基因来源 引物序列 扩增长度/bp 备注 5′-GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA-3 猪线粒体基因 内源 212 内对照 5'-ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3' 5′-GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3' 牛线粒体基因 内源 271 内对照 5-GTAGGCTGGGGAATAGTACGA-3' 5'-TATTAGGCCTCCCCCTTGTT-3" 294（山羊） 羊线粒体基因 内源 内对照 5'-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3' 295（绵羊） 5'-CTATTCGGCTATGACTGG-3' NPT II 外源 263 筛查检测 5′-TGAGATGACAGGAGATCC-3' 5'-GTCATTAGTTCATAGCCCATA-3 CMV启动子 外源 483 筛查检测 5'-GCGGAGTTGTTACGACATTT-3' 5′-TGTTTATTGCAGCTTATAATGG-3' SV40 PolyA 外源 96 筛查检测 5'-ACAAACCACAACTAGAATGC-3' 5'-TTCTTCAAGTCCGCCATG-3' GFP 外源 311 筛查检测 5'GTGTTCTGCTGGTAGTGG-3′' 5.2药品及试剂 TagDNA聚合酶，琼脂糖（电泳纯），三氯甲烷（氯仿），异丙醇，异戊醇，70%乙醇，分子量标准 （100bp～2000bp），TE缓冲液，50倍TAE电泳浓缩缓冲液，动物组织裂解缓冲液蛋白酶K，醋酸钠 （NaAc）。试剂配制见附录C。 6仪器 6.11 PCR仪。 6.2凝胶成像系统。 6.3核酸蛋白分析仪。 6.4高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机。 6.5电泳仪。 2