SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3498—2013 温泉鱼类志贺邻单胞菌病检疫技术规范 Quarantine protocol for Plesiomonas shigelloides fromGarra rufa 行业标准信息服务平台 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3498—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国四川出入境检验检疫局、四川农业大学、中华人民共和国重庆出 入境检验检疫局。 本标准主要起草人：余华、杨光友、王昱、严玉宝、李应国、岳川、刘洋洋、陈世界、周岷江、胡娟、 崔鹏博。 行业标准信息服务平台 SN/T3498—2013 温泉鱼类志贺邻单胞菌病检疫技术规范 1范围 本标规定了温泉鱼类志贺单胞菌病的检疫技术规范 本标准适用于温泉鱼类志贺邻单胞菌病的临床诊断和分离鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3临床诊断 3.1临床症状 鱼群出现厌食或不吃食；病鱼静止不动或阵发性乱游、乱窜，或在池边摩擦，最后衰竭而死；鱼体出 现体色异常，呈现黑色；死鱼有较明显的出血症状。 3.2病理变化 病鱼鳍条基部及鱼体两侧轻度充血，体表侧线两侧出现白斑或溃疡斑，随着病情的加重，斑的颜色 逐渐变深，严重病情时斑的颜色呈现黑色，鳃盖周围有出血点或出血斑；鳃、肝、肾的颜色均较淡，呈现灰 白色；肝脏出现出血点，胆囊肿大；腹腔内积有腹水，腹水呈淡黄色透明或红色浑浊；肠道出血或肠壁变 透明，可见肠内容物 疫病的详细描述参见附录A。 4分离鉴定 4.1设备和器械 4.1.1生物安全柜。 4.1.2音 普通光学显微镜。 4.1.3高压灭菌锅。 4.1.4恒温培养箱（37℃±1℃）。 4.1.5解剖器械。 4.1.6全自动生化鉴定系统。 4.2培养基和试剂 以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的二级水。 4.2.1普通营养琼脂平板，制备见附录B的B.1。 1 SN/T3498—2013 4.2.2革兰氏染色液，配制见B.2~B.4。 4.2.3SIM培养基，配制见B.5。 4.2.4Kovacs试剂，配制见B.6。 4.2.5市售触酶试剂。 4.2.6市售氧化酶试剂。 4.2.7糖发酵试验管，配制见B.7。 4.2.8O/129诊断纸片，制作见B.8。 4.2.9市售生化鉴定管（具体名称见附录C)。 4.3类志贺邻单胞菌的分离和鉴定 4.3.1样品采集 挑选5～10尾濒死的或带有上述症状的温泉鱼，使用无菌水冲洗体表后，用75%的酒精棉球擦拭 体表，无菌操作解剖发病温泉鱼，采用接种环从病鱼出血点或出血斑处、肝脏、脾脏和肾脏蘸取渗出物 4.3.2分离和纯化 接种环划线接种到普通营养琼脂平板培养基，37℃恒温培养24h。挑取数个可疑单菌落，划线培 长良好，形成边缘整齐、表面湿润、中央隆起、光滑、半透明、灰白色至淡黄色的圆形菌落。 4.3.3鉴定 4.3.3.1染色镜检 挑取疑似菌落涂片到干净的玻璃载玻片，在酒精灯火焰上方固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水 洗；滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脱色，约30s（或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去， 再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s水洗；滴加沙黄复染液，复染1min；水洗，风干，镜检。志贺邻单胞菌 为革兰氏阴性直杆菌，两端圆润，染色呈红色。 标准信 4.3.3.2初步生化试验 4.3.3.2.1氧化酶试验 挑取少许单菌落涂抹于无菌的白色的滤纸片上，滴加1%盐酸四甲基对苯二胺（或商品化）氧化酶 4.3.3.2.2触酶试验 挑取少许单菌落涂抹于干净的载玻片上，滴加2～3滴3%过氧乙酸（或商品化）触酶试剂，10s~20s 出现大量气泡者为阳性，否则为阴性。 4.3.3.2.3运动性和吲哚试验 取氧化酶、触酶阳性菌落穿刺接种SIM培养基，37℃培养24h，观察。细菌沿穿刺线向两侧扩增 者为具运动性，否则为不具运动性；往管中加人数滴三氯甲烷（此时不要与火接触），2min后再向管中 加数滴Kovacs试剂，出现红色者为吲哚阳性，否则为阴性。 4.3.3.2.4糖发酵试验 挑取吲哚阳性，有运动活性的可疑菌落少许。分别接种葡萄糖、麦芽糖发酵管（见B.7）。37℃培 2