SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3488—2013 猪劳森氏胞内菌荧光PCR检疫技术规范 Quarantine protocol for real-time PCR of Lawsona intracellularis 行业标准信息服务平台 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3488—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国四川出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：陈世界、杨苗、田绿波、林华、严玉宝、胡娟、薛昌华、余华、郭杨。 行业标准信息服务平台 SN/T3488—2013 猪劳森氏胞内菌荧光PCR检疫技术规范 1范围 本标准规定了猪劳森氏胞内菌荧光PCR检疫的技术要求。 本标准适用于猪劳森氏胞内菌的检测。 2夫 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T2123出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 3仪器和试剂 3.1主要仪器 荧光定量PCR仪、高速冷冻离心机、旋涡混匀器、恒温循环水浴槽、低温冰箱、可调单头微量移液器 3.2主要试剂 Qiagen动物粪便DNA提取试剂盒；Qiagen动物血液与组织DNA提取试剂盒；ABI或者Bio Rad荧光定量PCR反应预混液；除非特别指定，本标准试验用水均为满足GB/T6682的三级水。 荧光PCR扩增所用的引物和探针的序列见表1。 表1引物和TaqMan探针 引物和探针 序列 长度/bpTm值/℃GC含量/% 上游引物 5'-GAGCACGATTACAAATTGCTTCA-3 23 51.7 39 下游引物 5-TGCTATCTCTGCTGCATGTAATGA-3 24 54 42 TaqMan探针5'-FAM-TCCCTGCACCTCCTTGAATACAATCCACA-TAMRA-3 29 61.5 48 4样品的采集、运输和保存 4.1粪便样品的采集及保存 采集的样品最好是在动物使用抗菌药物之前，从直肠内采集的新鲜粪便。少量采集时，以灭菌的棉 1）本标准中列出商品名，是Qiagen、ABI或Bio-Rad公司提供的适合的市售产品的实例，给出这些信息是为了方 便本标准的使用者，并不代表对这些产品的认可。 1 SN/T 3488—2013 拭子从直肠深处熊取粪便，并立即投入火菌的试管内密封，或在试管内加入少量样品保存液（H三7.4 的磷酸缓冲液）后密封。采集较多量的粪便时，可将动物肛门周围消毒后，用带上胶手套的手伸入直肠 内取粪便，也可用压舌板插入直肠，轻轻用力下压，刺激排粪，收集粪便。所收集的粪便装人灭菌的容器 内，密封并贴上标签。样品采集后于4℃冷藏保存，然后立即运送至实验室（夏季不超过24h，冬季不超 过2d）。短时间不能送达的样品应于一20℃冷冻保存。样品运送时应保持冷冻状态，并防止倾倒。送 4.2肛拭子采集 每个灭菌离心管中加人1mL样品保存液（pH=7.4的磷酸缓冲液）。用灭菌的棉拭子插人肛门， 转动至少3圈，蘸取粪便。之后立即将拭子浸入样品保存液中，剪去露出部分，盖紧离心管，贴上标签， 密封低温保存。 4.3病变肠组织样品的采集 采集增生、出血的病变小肠肠管约6cm长。已死亡的动物应尽快采集（夏天不应超过2h，冬天不 超过6h），采集的动物病料必须新鲜，尽可能减少污染。样品组织应置于样品袋中，贴上标签，4℃冷藏 保存和运输。如病料不能立即进行检验，或须寄送到外地检验时，应加人适量的样品保存剂（饱和盐水 或30%甘油缓冲液），容器加塞封固。 4.4其他采样技术 病变样品的采集参见附录A。本标准未界定的采样、运输及保存技术按照SN/T2123。 5DNA提取 宁 实时荧光PCR检测方法 6.1对照设立 6.1.1阳性对照 用已知猪劳森氏胞内菌阳性组织制备的DNA模板。 6.1.2阴性对照 用已知猪劳森氏胞内菌阴性组织制备的DNA模板。 6.1.3空白对照 用等体积的水代替DNA模板。 6.2扩增反应体系 实时荧光PCR扩增反应体系见表2。 2