SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2976—2011 鲑鱼立克次氏体检疫技术规范 巢式聚合酶链式反应法 Quarantine protocol for piscirickettsia salmonis by nested polymerase chain reaction 行业标准信息服务平台 2011-09-09发布 2012-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2976—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 为非等效。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国深圳 出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：谢明星、彭小莉、刘棠、陈双雅、刘、贾鹏、张利峰、陈伟玲、王群力、王景明。 行业标准信息服务平台 SN/T 2976—2011 鲑鱼立克次氏体检疫技术规范 巢式聚合酶链式反应法 1范围 本标准规定了鲑鱼立克次氏体巢式聚合酶链式反应检测方法。 本标准适用于鲑鱼立克次氏体检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp(basepair)：碱基对 DNA（deoxyribonucleicacid）：脱氧核糖核酸 dNTP（deoxyribonucleosidetriphosphate）：脱氧核苷三磷酸 EDTA(ethylene diaminetetraacetic acid):乙二胺四乙酸 Nested-PCR（nestedpolymerasechainreaction）：巢式聚合酶链式反应 SDS(sodiumdodecyl sulfate)：十二烷基硫酸钠 Taq（Thermusaquaticu）：水生热栖菌 TE:Tris-CI、EDTA缓冲液 4i 设备和试剂 4.1设备 4.1. 1 一20℃低温冰箱。 4. 1.2 组织匀浆器。 4.1.3 高速冷冻离心机。 4.1.4 生物安全柜。 4. 1. 5 生化培养箱。 PCR 仪。 4. 1. 6 4. 1.7 电泳仪。 4.1.8 凝胶成像仪或紫外观察灯。 1 SN/T 2976—2011 4.2试剂 4.2.1双蒸水应符合GB/T6682中一级水规格。 4.2.2琼脂糖（电泳纯）。 4.2.3鲑鱼立克次氏体参考毒株。 4.2.4Taq酶：5U/μL。一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 4.2.5DNA相对分子质量标准(DNAMarker)：100bp~1000bp。 4.2.6 溴化乙锭溶液（10μg/μL）：见附录A。 4.2.7TE(Tris-HCI、EDTA)缓冲液、10XPCR缓冲液、电泳缓冲液和电泳样品缓冲液：见附录A。 5 巢式聚合酶链式反应（nested-PCR） 5.1采样 适用于本病检测的是临床感染的鱼，体长≤4cm的幼鱼取整条鱼，体长4cm～6cm及以上的鱼则 取皮肤溃疡部位和出现病变的肾、脾、肝、胃、、肌肉和脑组织等。 最佳的目标组织是肝、肾、脾及小肠。 5.2核酸的抽提 用经典的酚-三氯甲烷萃取法（见附录B)或商业化DNA提取试剂盒。 5.3引物的设计 外部引物序列如下： EubB(27F):5'-AGA-GTT-TGA-TCM-TGG-CTC-AG-3" EubA(1518R):5'-AAG-GAG-GTG-ATC-CAN-CCR-CA-3" 内部引物序列如下： PS2S(223F):5'-CTA-GGA-GAT-GAG-CCC-GCC-GCG-TTG-3" PS2AS(690R):5'-GCT-ACA-CCT-GAA-ATT-CCA-CTT-3* 5.4PCR扩增体系 PCR扩增在标准的20μL的反应体系中进行，包括1XPCR缓冲液，1.5mmol/L氯化镁， 部引物扩增反应的模板用0.2μL外部引物的扩增反应产物。 5.5PCR反应条件 外部引物扩增反应程序是：94℃预变性5min，94℃1min，5℃2min和72℃3min循环35次， 最后72℃10min。 内部引物扩增反应程序是：95℃预变性5min，95℃1min，62℃2min和72℃1min循环35次， 最后72℃10min。 5.6扩增产物的检测 用琼脂凝胶电泳和溴化乙锭染色检测468bp的内部引物扩增反应产物。