SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2978—2011 动物源性产品中鸡源性成分 PCR检测方法 PCR method for the detection of chicken components inanimal derivedproducts 行业标准信息服务平台 2011-09-09发布 2012-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2978—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学院。 本标准主要起草人：宗卉、曹琛福、张彩虹、杨俊兴、吕建强、阮周曦、曾少灵、陶虹、孙洁、刘建利、 廖丽珊、卢体康、花群义、秦智锋。 行业标准信息服务平台 SN/T 2978—2011 动物源性产品中鸡源性成分 PCR检测方法 1范围 本标准规定了动物源性产品中鸡源性成分检测的PCR方法。 本标准适用于动物源性产品中鸡源性成分的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB4789.1食品安全国家标准食品微生物学检验总则 GB/T5009.1食品卫生检验方法理化部分总则 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 SN/T1193基因检验实验室技术要求 3试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求。 3.1鸡源性成分检测用引物（对）序列： 标准信息服务平台 上游：5'-ctataatcgataatccacgattca-3 下游：5'-cttgacctgtcttattagcgagg-3 3.2裂解液（参见附录A)。 3.3电泳缓冲液（参见附录A）。 3.4溴化乙锭（10mg/mL）（参见附录A）。 3.5阳性对照样品：采用已知含有鸡源性成分的样品。 3.6 阴性对照样品：采用已知不含鸡源性成分的样品。 3.7 空白对照：采用与模板等体积的双蒸水。 4仪器设备 4.1离心机（最大转速14000r/min）。 4.3电泳仪。 4.4凝胶成像仪。 4.5恒温水浴锅（0℃~100℃）。 1 SN/T 2978—2011 5试样选取与制备 根据不同的样品，饲料样品按照GB/T14699.1采样，或若粒度为20目称取200mg，60目称取 100mg，100目称取50mg。食品样品按照GB/T5009.1和GB4789.1采样。 将实验室样品研磨待用。 6检验步骤 6.1样品DNA提取 称取上述混匀样品50mg于1.5mL离心管中，加人600μL～800μL裂解液，65℃30min，期间不时 振荡混匀；12000r/min离心5min；转移上清液于洁净离心管中，加400μL三氯甲烷/异戊醇（24：1），混 匀；12000r/min离心5min，取上清液；加0.8倍体积异丙醇，沉淀；12000r/min离心5min，弃上清液； 75%乙醇洗涤一次，晾干；加人50μL双蒸水（ddHO)溶解沉淀，制成DNA溶液，待用。 也可用等效DNA提取试剂盒提取样品DNA。 6.2PCR扩增 反应体系：体积为25μL，包括2X×PCR缓冲液12.5μL、dNTPs（2mmol/L）5μL、引物对（10nmol/L）各 0.5μL、DNA聚合酶（1U/μL)1μL、模板DNA(100ng土50ngDNA)5μL、双蒸水0.5μL。 反应条件：PCR反应条件随不同的PCR仪略有改变。94℃预变性1min~3min；94℃变性30s~ 60s，63℃退火30s~60s72℃延伸30s60s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。 6.3PCR扩增产物电泳检测 称取1.5g琼脂糖于100mL电泳缓冲液中，加热，充分溶化后，加入溴化乙锭至终浓度为0.5μg/mL， 制胶。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将8μL各PCR扩增产物分别和3uL加样 缓冲液混合，点样。9V/cm恒压，电泳至漠酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。凝胶成像仪下观察电泳结果 信息服务平台 并记录。 6.4测序 当电泳结果出现可疑阳性时，将PCR扩增产物进行DNA测序 7结果判断与表述 7.1PCR扩增产物电泳并序列分析 实验在阳性对照出现131bp大小的条带，阴性对照无该条带出现、空白对照无条带出现时，视为该 实验成立。在实验成立的前提下，样品出现131bp左石天小的扩增产物则判为可疑阳性，否则为阴性。 将可疑阳性的PCR扩增产物进行核酸序列测定，与GEENBANK中鸡线粒体DNA相对应片段的 7.2结果表述 在实验成立的前提下，PCR扩增产物电泳检测结果阴性者判为不含有鸡源性成分，表述为未检出 2