SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2975—2011 鱼华支睾吸虫囊呦鉴定方法 Identification for metacercaria of Clonorchis sinensis in fish 行业标准信息服务平台 2011-09-09发布 2012-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2975—2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局检验检疫技术中心、中国疾病预防控制中 疫局。 本标准主要起草人：陈信忠、郭书林、陈韶红、龚艳清、李树清、杨俊萍、陈飞、陈家旭、张仪、徐淑菲、 孔繁德、胡薇、黄燕。 行业标准信息服务平台 SN/T 2975—2011 鱼华支墨吸虫囊呦鉴定方法 1范围 本标准规定了鱼体内华支睾吸虫囊坳的压片检查法、蛋白酶消化法以及PCR鉴定方法。 本标准适用于鱼类华支睾吸虫囊坳的病原鉴定及其流行病学调查和监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1193基因检验实验室技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 囊呦metacercaria 复殖吸虫幼虫发育中的一个阶段。华支睾吸虫尾进入第二中间宿主后或附着水生植物上，脱掉 尾部，躯干部变圆，头腺分泌囊壁而成为具有感染能力的囊蚜。 3.2 中间宿主intermediatehost 寄生虫在幼虫或无性生殖时期所寄生的宿主。华支辜吸虫的幼虫需要经过两个中间宿主，第一中 间宿主包括多种淡水螺，第二中间宿主包括多种淡水鱼类和虾类。 3.3 终末宿主definitivehost 寄生虫成虫或有性生殖阶段所寄生的宿主。华支睾吸虫的终未宿主主要包括人、犬、猫、猪等哺乳 动物。 4试剂和材料 4.1所有化学试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格，用于DNA提取及 PCR实验的水需用灭菌双蒸水。PCR实验应在符合SN/T1193要求的实验室进行。Taq酶、dNTPs （含dATP、dUTP、dCTP,dGTP)等核酸提取及PCR所需试剂可选用商品化试剂和试剂盒。 4.2阳性对照为华支睾吸虫囊或成虫。 4.3PCR正向引物CS1:5'-CGAGGGTCGGCTTATAAAC-3" 反向引物CS2：5-GGAAAGTTAAGCACCGACC-3" 4.4胃蛋白酶消化液（见A.1)。 4.5盐酸卡红染液（见A.2）。 1 SN/T 2975—2011 4. 6 盐酸酒精分色液（见A.3）。 4.7 CTAB溶液（见A.4）。 4.8 抽提液1（见A.5）。 4.9 抽提液2（见A.6）。 4.10TBE电泳缓冲液（见A.7）。 4. 11 核酸染色剂（EB)（见A.8）。 4. 12 上样缓冲液（见A.9）。 4. 13 甲醛、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、中性树脂。 5# 器材和设备 5.1PCR仪。 5.2显微镜（具目镜测微尺）。 5.3立体显微镜。 5.4高速离心机。 5.5切片机和切片器具。 5.6 解剖器具。 5.7 微量移液器。 5.8染色缸。 5.9 载玻片和盖玻片。 61 鱼体内华支睾吸虫囊呦的诊断 6.1显微镜检查方法 6.1.1压片检查法 6.1.1.1淡水鱼类为华支睾吸虫的第二中间宿主，囊坳可寄生于鱼体的肌肉、皮、头、鳃、鳍及鳞等各部 分，尤其在鱼体中部的背部和尾部肌肉较多。在鱼体背部及肛区至尾鳍的基部各取约2g肌肉，放在两 张载玻片之间，用力压薄，用棉线扎紧玻片两端。 6.1.1.2将玻片放在低倍显微镜下观察，检查各种囊。新鲜鱼肉中华支睾吸虫囊蝴一般为椭圆形， 大小（90um～110um）×（100μm～140μm），其外有一层鱼组织反应所产生的纤维层，囊壁分两层，外 壁较厚，内壁较薄，囊内有一卷曲的活动的，可见口吸盘和腹吸盘，腹吸盘不方为一椭圆形充满黑色颗粒 的排泄囊。在鱼肉中检查到具备上述特征的囊坳，可初步判定为华支睾吸虫囊蚜。 6.1.2蛋白酶消化法 6. 1.2. 1 取鱼体背、腹两侧及尾部肌肉，用剪刀剪碎。 6.1.2.2取5g鱼肉，置于烧杯中，用50mL胃蛋白酶消化液（见A.1）充分混匀后置37℃温箱消化 过夜。 6. 1. 2. 3 消化后的悬液用40目铜筛过滤，滤液用生理盐水洗涤沉淀3次5次。 6. 1. 2. 4 全部沉淀分次吸入玻璃平皿，用解剖镜检查沉淀中的囊坳。 6. 1. 2. 5 按6.1.1.2观察囊坳，并初步判定结果。 6. 1.3 囊标本制作方法 6.1.3.1 按6.1.1或6.1.2方法采集囊坳。 2