SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2622—2010 柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Xanthomonas axonopodis pv. citri 行业标准信息服务平台 2010-05-27发布 2010-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2622—2010 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国四川出入境检验检疫局、四川省植物检疫站。 本标准主要起草人：何万兴、向勇、何天江、宁红、范京安、何羽。 行业标准信息服务平台 SN/T2622—2010 柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了进出境植物检疫中柑桔溃疡病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于进出境芸香科植物及其产品感染柑桔溃疡病菌的鉴定。 2原理 柑桔溃疡病菌，Xanthomonasaronopodispv.citri（Hasse）Vauterinetal.1995，异名X.campes trispv.citri（Hasse）Dye1978，属原核生物总界Procaryotae，细菌界Bacterium，薄壁菌门Gracili- cutes，黄单胞杆菌科Xanthomonadaceae，黄单胞菌属Xanthomonas，是为害芸香科植物叶片、枝条、果实 的重要病原菌，其为害引起的典型症状及病原菌形态特征等信息参见附录A。该病原菌的为害症状、形 态特征、致病性反应、免疫学特性、PCR特异性反应是制定本标准的依据。 3试剂 除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水 3.1分离用试剂 次氯酸钠（NaCIO）、氯化钠（NaCI）、蛋白陈、蔗糖、磷酸氢二钾（K,HPO4）、硫酸镁（MgSO： 7H2O)、琼脂、盐酸（HCI)、95%乙醇等。培养基配方详见附录B。 3.2PCR、ELISA检测所用试剂 PCR检测试剂及配制见附录C,ELISA试剂及配制见附录D。 你准 4仪器及用具 超净工作台、天平、高压灭菌锅、培养箱、摇床、生物显微镜、高速台式离心机、PCR扩增仪、水平电 泳仪、凝胶成像系统、PCR反应管、离心管、酶联板、微量移液器、移液器、剪刀、接种针、镊子、培养皿、三 角瓶、试管、酒精灯、吸管、自封式塑料袋等。 5实验室检验 5.1症状观察 观察待检样品是否有柑桔溃疡病菌为害的症状，柑桔溃疡病典型症状参见附录A第A.5章。对有 柑桔溃疡病典型症状样品可任选分离鉴定、PCR或间接ELISA三者之一进行检测，对无柑桔溃疡病典 型症状或可疑柑桔溃疡病典型症状的样品选用PCR或间接ELISA进行检测。 5.2柑桔溃疡病菌的分离鉴定 5.2.1分离培养 1 SN/T 2622—2010 无菌条件下晾干。取样品病健交界处约2mm×3mm小块组织放入0.2mL无菌水中，用灭菌玻璃棒 捣碎，在室温下浸泡5min～10min，使组织中的细菌流人水中配成悬浮液，将悬浮液在蔗糖蛋白陈培养 基平板上划线，28℃培养2d～4d，观察菌落形态和病原菌形态特征，柑桔溃疡病菌菌落形态和菌体特 征参见附录A第A.6章。 5.2.2致病性测定 用已知的柑桔溃疡病菌菌株作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照，将待测纯培养菌株及阳性对照 从培养基上刮下后用无菌水配成10°CFU/mL～10°CFU/mL菌悬液，针刺接种到健康的甜橙类柑桔 新梢叶片上，28℃~30℃、相对湿度95%～100%条件下培养7d～14d，观察是否有柑桔溃疡病典型 症状。 5.3PCR检测 用已知的柑桔溃疡病菌菌株作为阳性对照，非柑桔溃疡病菌的植物病原细菌作为阴性对照，双蒸水 作为空白对照，PCR制样及检测方法见附录C。 5.4间接ELISA检测 制样及检测方法见附录D。 6 结果评定 6.1通过分离培养进行检测的，分离培养的菌落形态及菌体形态符合附录A第A.6章描述，且分离纯 培养物经PCR、间接ELISA或致病性测定三者之一检测为阳性，样品判定为带菌样品。否则不带有柑 桔溃疡病菌。 6.2通过PCR或间接ELISA检测的,PCR或间接ELISA检测结果为阳性，样品判定带有柑桔溃疡病 菌。否则不带有柑桔溃疡病菌。 业校 7样品保存及处理 检出带菌样品以及所分离菌株至少保存3个月并做好记录，以备复验、谈判和仲裁之用。 服务平台 样品及菌株保存期满后做灭活处理。 2