SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2497.13—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第13部分：荧光原位杂交试验 Test method of import and export dangerous chemicals- Part 13:Florescence in-situ hybridization 行业标准信息服务平台 2010-03-02发布 2010-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2497.13—2010 前言 第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验； 第2部分：空斑形成细胞（PFC)试验； 第3部分：大型泽繁殖试验； 第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验； 第5部分：睾丸细胞UDS试验； 第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验； 第7部分：小鼠耳肿胀试验； 第8部分：窝淋巴结试验； 第9部分：血清溶血素测定试验； 第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验； 第11部分：种系突变试验； 第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验； 第13部分：荧光原位杂交试验； 第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验； 第15部分：PCR-SSCP实验； 第16部分：Western-Blot实验； 第17部分：哺乳动物行为毒理学试验； 第18部分：DNA加合物的检测方法； 第19部分：NorthernBlot实验； 第20部分：Bradford法测定蛋白质含量； 第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验； 第22部分：DNA的Tm值测定方法； 第23部分：细胞器的分离实验方法； 第24部分：细胞免疫功能体外检测方法； 隹信息服务平 第25部分：体液免疫功能试验， 第26部分：巨噬细胞功能试验； 第27部分：流式细胞术检测调亡； 第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用； 第29部分：生化需氧量（BOD）测定。 本部分为SN/T2497系列标准的第13部分。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检 疫局。 本部分主要起草人：张园、王利兵、王华、赵琢、韩伟、熊中强。 本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T2497.13—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第13部分：荧光原位杂交试验 1范围 SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品荧光原位杂交试验的主要试剂和材料、主要仪器、 试验步骤、试验结果和试验报告。 本部分适用于进出口危险化学品荧光原位杂交试验。 2术语、定义和缩略语 2.1术语和定义 下列术语和定义适用于本部分。 2. 1. 1 核酸探针nucleicacid probe 能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核苷酸链。 2.2缩略语 下列缩略语适用于本部分。 2.2.1 DAPI4'6-diamidino-2-phenylindole46-联-2-苯基吲哚 2.2.2 PBS磷酸盐缓冲液 2.2.3 PI PropidiumIodine碘化丙啶 3原理 荧光原位杂交技术（FlorescenceIn-SituHybridization，简称FISH）是一种利用非放射性的荧光信 号对原位杂交样本进行检测的技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性，荧光信号的直观性和原位杂交 的高准确性结合起来，通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交，在荧光显微镜下 对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常组织样本进行检测 4主要试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水为灭菌蒸馏水或超纯水。 4.1PBS:在800mL蒸馏水中溶解8gNaCl,0.2gKCl,1.44gNazHPO和0.24gKH,PO4,用HCl 调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，在1.034×105Pa（151bf/in²）高压下灭菌20min，保存于室 温。 4.220×SSC：在800mL水中溶解175.3gNaCl和88.2g柠檬酸钠，加人数滴10mol/LNaOH溶液 调节pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。 4.32XSSC，由20×SSC溶液稀释而成。 4.4变性液：4mL20×SSC；8mL蒸馏水；28mL甲酰胺。每次新鲜配制。 4.5杂交液：5×SSC,50%甲酰胺（5×Denharts，100μL待检DNA，10%硫酸葡聚糖）。 1 SN/T 2497.13—2010 4.6 杂交后洗涤液：20×SSC4mL，蒸馏水16mL，甲酰胺20mL。每次新鲜配制。 4.7梯度乙醇。 4.81XPBD:4XSSC/0.05%Tween溶液。 4.9PI或DAPI. 5主要仪器 5.1恒温箱。 5.2荧光显微镜。 6试验方法 6.1用RNase处理标本片 将铺有染色体或细胞的玻片放人含有100μg/μuLRNase的溶液中60℃（70℃)→2×SSC室温洗 4次，2min/次→70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇在一20℃中进行脱水2min/次→室温干燥。 6.2变性 70℃变性液中孵育2min，然后立即移人预冷的70%乙醇中作用2min，再依次移人80%、90%和 100%的一20℃预冷乙醇内，每次2min，室温干燥。 6.3杂交 6.3.1将玻片放在小盒（平血）内，底层与少许水，保持玻片有一定湿度，37℃，30min。 6.3.2探针变性：取1.5mL生物素标记DNA探针（10μg/uL）加人到30uL杂交液中，混匀后放入 70℃水浴变性5min后迅速放人冰冷却后加到玻片上（每张玻片30μL）用盖玻片盖好，置37℃，4h～ 6 h。 6.3.3去掉盖玻片，浸入洗涤液中，43℃洗20min，然后用2×SSC37℃洗2次，再浸人1X×PBD溶液 中。 6.4杂交信号显示 5 min。 6.4.2去掉石蜡膜，加60μL荧光标记Avidin（抗生物素蛋白)37℃,20min。 6.4.3在1XPBD溶液中洗片3次，每次2min。 6.4.4杂交信号放大，在玻片上加60μL封闭液2，室温下作用5min，加抗Avidin的抗体37℃， 20 min. 6.4.5用1×PBD洗3次，再次2min（室温）加终止液1.6μL，室温5min加荧光标记Avidin，37℃， 20min，用1XPBD洗3次。 6.4.6染色体显色，在玻片上加10uLPI或DAPI等荧光染料，再加抗荧光淬灭剂封片液室温反应 5min，加盖玻片在荧光显微镜下观察。 7试验结果 可采取镜下计数细胞、照相的方法，或可采用专业荧光原位杂交分析系统进行结果分析。