SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2497.11—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第11部分：种系突变试验 Test method of import and export dangerous chemicals- Part 11:Germ-line mutation 行业标准信息服务平台 2010-03-02发布 2010-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2497.11—2010 前言 第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验； 第2部分：空斑形成细胞（PFC)试验； 第3部分：大型泽繁殖试验； 第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验； 第5部分：睾丸细胞UDS试验； 第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验； 第7部分：小鼠耳肿胀试验； 第8部分：窝淋巴结试验； 第9部分：血清溶血素测定试验； 第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验； 第11部分：种系突变试验； 第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验； 第13部分：荧光原位杂交试验； 第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验； 第15部分：PCR-SSCP实验； 第16部分：Western-Blot实验； 第17部分：哺乳动物行为毒理学试验； 第18部分：DNA加合物的检测方法； 第19部分：NorthernBlot实验； 第20部分：Bradford法测定蛋白质含量； 第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验； 第22部分：DNA的Tm值测定方法； 第23部分：细胞器的分离实验方法； 第24部分：细胞免疫功能体外检测方法； 隹信息服务平 第25部分：体液免疫功能试验， 第26部分：巨噬细胞功能试验； 第27部分：流式细胞术检测调亡； 第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用； 第29部分：生化需氧量（BOD）测定。 本部分为SN/T2497系列标准的第11部分。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检 疫局。 本部分主要起草人：张园、王利兵、熊中强、赵琢、李学洋、庞震 本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 1 SN/T 2497.11—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第11部分：种系突变试验 1范围 SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品安全试验中种系突变试验的试剂和器材、试验方 法、试验步骤、试验结果和试验报告。 本部分适用于进出口危险化学品种系突变试验。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过SN/T2497的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 部分。 GB14924.1实验动物配合饲料通用质量标准 GB14925实验动物环境及实施 消毒技术规范 3试剂和器材 3.1试剂 3.1.10.9%氯化钠溶液 3.1.20.075mol/L氯化钾溶液 3.1.31%高碘酸溶液：1g高碘酸溶解在100mL二次水中，4℃冰箱保存。 3.1.4磷酸缓盐冲液（pH7.4)：配制方法见《消毒技术规范》2.3.8.2.2(9）。 3.1.5睾丸细胞分离液（TIM):取NaCl6.0g，KCl3.3g,CaCl²·2H,O0.18g,MgSO·7HzO 0.3g,NazHPO,0.85g,KHPO0.09g，葡萄糖10g0.5%酚红溶液0.8mL，加蒸馏水溶解至1L， pH为7.2~7.3,4℃保存。 3.1.6Zenkert液:称量K,CrzO25g,NazSO·10Hz010g,加H,O溶解至1000mL。 3.1.7Helley氏固定液：临用前，加入甲醛溶液（36%~40%）50mL到950mLZenkert液中。 3.1.810%甲醛固定液：1份甲醛溶液（36%～40%）与3份双蒸水混合。 3.1.9Schiffs液：1g碱性品红溶于200mL刚沸腾过的蒸馏水中（注意放碱性品红时不要在沸腾时放 入），震荡5min，待溶液冷却至50℃，粗滤纸过滤，在滤液中加人1mol/L盐酸20mL，待冷却到25℃ 时，加入1g偏重亚硫酸钠，溶解后冷却至室温，室温避光24h，加新鲜活性碳2g充分摇荡数分钟，滤纸 过滤，于4℃冰箱保存。 蒸馏水中），先将乙液煮沸后去火，缓慢加入已溶解的甲液，后立即缓慢加人0.5g氧化汞，再次煮沸，迅 速冷却后加人纯冰醋酸8mL过滤使用（注意：在加人氧化汞和钾明钒时要缓慢，注意安全）。 3.2仪器和器材 实验室常用设备、生物显微镜、恒温水浴箱37℃士5℃、离心机、解剖剪、镊子、注射器、灌胃针头、 离心管、吸管、滴管、试管架、载玻片、塑料吸瓶、干净纱布、滤纸等。 1 SN/T 2497.11—2010 4试验方法 4.1试验动物 成年小鼠（体重25g～30g），或大鼠（体重180g～220g）。动物总数不少于30只，雌雄各半。试 验动物饲养条件应符合GB14924.1和GB14925有关规定。 4.2受试物 溶剂通常采用蒸馏水、等渗盐水、植物油、食用淀粉、羧甲基纤维素钠等。如使用特殊溶剂或载体， 应有参考资料说明其成分。 4.3剂量分组 应进行预试验以选择最高剂量，为避免出现假阴性结果应适当增大剂量范围。如果受试样品具有 毒性，应在第一个采样时间点设三个剂量，设置的剂量应包括从最大毒性至最小毒性或无毒性的范围。 第二次采样时间点仅需设置最高剂量。按等比级数2向下设置中、低剂量组。 5试验步骤 5.1.1限度试验 如果单次染毒剂量不小于2000mg/kg，未出现毒性效应，且根据资料预期受试物无遗传毒性，则 不需要进行其他染毒剂量的试验。 5.1.2染毒 一般情况下染毒一次，或者为便于大容量给药，也可分散剂量染毒，即同一日染毒两次，其间隔时间 不超过几小时。 高剂量组动物分为A、B两个亚组，分两次采集样品，啮齿类动物采样时间一般为1.5个正常期中 的间隔期，即A组于末次染毒后12h~18h采集样品。B组于末次染毒后36h～42h采集样品；中、低 剂量组均于末次染毒后12h～18h采集样品。如果采用多次染毒方式，只需在最后一次染毒后12h～ 18h采一次样。 5.1.3制备细胞混悬液 用颈椎脱白法处死动物，迅速摘取一侧睾丸，用TIM液冲去血污，置于小平皿中，去除白膜，将曲细 精管剪成碎段，加人3mLTIM液的反复吹打后，经铜网过滤到5mL离心管中，以1500r/min离心 5min，弃上清，加TIM液洗涤细胞2次，再加1.5mL的TIM液制成细胞混悬液。 5.1.4固定 取细胞混悬液于洁净玻片上滴片，每只动物制片两张，静置5min后，滴加Helly氏固定液数滴预 固定10min，染缸中Helly氏液再固定1h，用70%乙醇冲洗几次后，放到70%乙醇待染。 5.1.5染色 将有细胞的玻片用蒸馏水冲洗几次后，1%高碘酸浸泡10min，Schiff's液浸泡10min，自来水冲洗 5min，蒸馏水冲洗2次，15%苏木素染色5min，自来水冲洗5min，蒸馏水冲洗2次，用1%盐酸酒精中 分色70s，自来水浸泡10min，蒸馏水冲洗2次，依次用50%、75%、80%、90%、95%、95%、100%、 100%酒精脱水，酒精二甲苯透明，二甲苯透明，树胶封片，镜检。 6试验结果 6.1阅片 所有玻片，包括阳性对照和阴性对照，在镜检前要分别编号。 一在低倍镜下检查制片质量，制片应全部染色体较集中，而各个染色体分散、互不重叠、长短收缩 适中、两单体分开、清晰地显示出着丝点位置、染色体呈红紫色。用油镜进行细胞染色体中期 分析。 2