SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2497.27—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第27部分：流式细胞术检测凋亡 Test method of import and export dangerous chemicals- Part 27:The usage of flow cytometry in apoptosis 行业标准信息服务平台 2010-03-02发布 2010-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2497.27—2010 前言 第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验； 第2部分：空斑形成细胞（PFC)试验； 第3部分：大型泽繁殖试验； 第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验； 第5部分：睾丸细胞UDS试验； 第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验； 第7部分：小鼠耳肿胀试验； 第8部分：窝淋巴结试验； 第9部分：血清溶血素测定试验； 第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验； 第11部分：种系突变试验； 第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验； 第13部分：荧光原位杂交试验； 第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验； 第15部分：PCR-SSCP实验； 第16部分：Western-Blot实验； 第17部分：哺乳动物行为毒理学试验； 第18部分：DNA加合物的检测方法； 第19部分：NorthernBlot实验； 第20部分：Bradford法测定蛋白质含量； 第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验； 第22部分：DNA的Tm值测定方法； 第23部分：细胞器的分离实验方法； 第24部分：细胞免疫功能体外检测方法； 第25部分：体液免疫功能试验； 第26部分：巨噬细胞功能试验； 第27部分：流式细胞术检测凋亡； 息服 第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用： 第29部分：生化需氧量（BOD)测定。 本部分为SN/T2497系列标准的第27部分 本部分修改采用《毒理学实验方法与技术》中的流式细胞检测方法，其有关技术内容与上述方法完 全一致，在标准文本格式上按GB/T1.1做了编辑性修改。 本部分的附录A为资料性附录。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检 疫局。 本部分主要起草人：冯智、王利兵、王华、李学洋、刘伟、丁宇。 本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 1 SN/T 2497.27—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第27部分：流式细胞术检测凋亡 1范围 SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品流式细胞术检测凋亡的术语和定义、试验方法和结 果分析。 本部分适用于进出口危险化学品流式细胞术检测调亡的试验。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本部分。 2. 1 凋亡apoptosis 也称为“程序性细胞死亡”，是一种细胞受环境刺激后，在基因调控之下所产生的自然死亡现象。凋 亡最初由特征性的形态变化来确定，包括：DNA的程序性降解、染色质浓缩、细胞缩小和碎裂。它可以 是生理性的，或由化疗药物及放射诱发。 2.2 坏死necrosis 活体内局部组织、细胞的死亡称为坏死。坏死组织细胞的代谢停止，功能丧失。坏死的形态变化可 以是由损伤细胞内的水解酶的降解作用引起，也可以由游走来的白细胞释放的水解酶的作用引起。 2.3 流式细胞术flowcytometry 是用流式细胞仪测量液相中悬浮细胞或微粒的物理性质及化学性质，如细胞大小、内部结构、 DNA、RNA、蛋白质、抗原等进行快速测定并可分类收集的一种现代分析技术。 3试验方法 3.1仪器设备 流式细胞仪； 一普通低速离心机； 一漩涡混匀仪； 微量加样器。 3.2试剂和耗材 台 -200目过滤尼龙网； 0.22μm的滤膜； -PBS缓冲液（pH=7.4）和蒸馏水（用滤器滤过）； 一流式细胞仪的保养试剂； 加样枪头。 试剂如自行配置,PBS和BingdingBuffer和PI的配置可以参见附录A。 1 SN/T 2497.27—2010 3.3试验步骤 3.3.1细胞悬液的制备 试验所用细胞可来源于各种组织也可为直接培养的细胞。若细胞来源于组织，需将其充分分离，并 用200目尼龙网过滤，收集细胞悬液。将细胞用PBS缓冲液洗涤两次［（500～800)r/min，5min/次」， 调整细胞浓度为1×106个/mL。 3.3.2分组 根据试验目的进行分组。要包含对照组，包括未标记的细胞、仅用AnnexinV标记的细胞，仅用PI 染色的细胞。 3.3.3 染色（如果使用试剂盒，加入试剂的剂量可以按说明书进行） a) 取100μL（1×105个细胞）到5mL流式加样管中； b) 加人荧光标记的AnnexinV试剂5uL至上述管中； ) 加人PI染料10μL人加样管中[PI的加入量可以根据不同的目的细胞和试验方案进行调整， 加人量可在（2～10）μL/管进行调整]； d) 轻轻摇动细胞，避光，室温保存15min。 3.3.4 上机检测 a) 在管中加入400μL的1×BindingBuffer（也可按照试剂盒的说明进行使用）； 在1h上流式细胞仪进行分析（选择相应的模块） 4试验结果 4.1不同阶段细胞的表型 由于细胞花丝期间也可以出现PS(膜磷脂酰丝氨酸)的外露,AnnexinV应与检测细胞活性的染料 PI联合后用来区分不同细胞，结果见表1。 表1 不同阶段细胞的表型 细胞类型 Annexin V PI 调亡细胞（早期） + 机械性损伤细胞 + 继发性坏死细胞 + + 正常细胞 4.2数据处理 准信息服务平台 选用适当的统计学方法对试验结果进行分析，判断受试物是否能引起调亡，及在不同浓度下的调亡 的差别是否有统计学意义。