SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2343—2009 菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法 Quarantine identification of bean pod mottle virus 行业标准信息服务平台 2009-07-07发布 2010-01-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T23432009 前 言 本标准的附录B、附录C、附录D为规范性附录，附录A为资料性附录 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫 局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局 本标准主要起草人：廖富荣、陈青、沈建国、郑耘、林石明、陈红运、郭琼霞、黄蓬英、王宏毅、吴媛， 游源浅、虞。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 SN/T2343—2009 菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了菜豆英斑驳病毒检疫鉴定的程序和方法。 本标准适用于可能携带菜豆荚斑驳病毒的大豆、菜豆等种子、苗木等植物繁殖材料的检疫鉴定，也 适用于介体昆虫中该病毒的检疫鉴定。 2原理 2.1分类地位 菜豆荚斑驳病毒（Beanpodmottlevirus）属于豇豆花叶病毒科（Comoviridae）、豇豆花叶病毒属 (Comovirus）的成员。可以分为亚组I和亚组Ⅱ两个亚组。相关资料参见附录A。 英文缩写：BPMV 2.2血清学特性 BPMV具有很强的免疫原性，制备的多克隆抗体可以检测大豆叶片、种子、草本寄主植物和介体昆 虫中的病毒。 2.3分子生物学特性 BPMV是一种正链RNA病毒，其基因组由两条正链RNA-1(约3.6kb)和RNA-2(约6.0kb)组 成，分别包裹在两个直径为28nm的等轴多面体粒体中。RNA-1编码5个复制所需的蛋白，RNA-2编 码一个推导的细胞间运动蛋白和两个外壳蛋白。根据其基因组序列可以设计用于分子检测的特异性引 物和探针，用来该病毒的特异性检测。 BPMV所在的豇豆花叶病毒属的种划分标准是： a）大外壳蛋白（Coatprotein，CP)的氨基酸序列同源性小于75%； 聚合蛋白酶的氨基酸序列同源性小于75%； ) 在可能的成分间没有假重组； 业标准信息服务平台 d) 抗原反应有差异。 3 主要仪器设备与试剂 3.1 主要仪器设备和用具 微量研磨仪； 酶标仪； 洗板机； 微量天平（感量：0.001g）； -PCR仪; 电泳仪； 一水平电泳槽； 凝胶成像仪； 高速冷冻台式离心机； 一 水浴槽； pH计; 各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、20μL、2μL）； SN/T2343—2009 各种吸头（1000μL、200μL、20μL、2μL）； —96孔酶标板； 离心管(1.5 mL、0.6 mL、0.2 mL)。 3.2主要试剂 主要试剂和缓冲液见附录B和附录C。 4检测样品的制备 4.1检测样品 将送检样品制备为血清学或分子生物学检测鉴定的检测分样品。对每批送检样品进行症状检查， 挑选具有褐色或黑色斑驳症状的种子（从种脐开始），或者选取具有斑驳、皱缩、褪绿等症状的叶片。 4.2DAS-ELISA和IC-RT-PCR检测样品的制备 种子样品：选取一定量的种皮作为检测分样品（如0.5g～1.0g），在液氮中充分研磨，回温后按比 例加人样品提取缓冲液继续研磨［通常1：（5~10)]。 叶片样品：选取一定量的叶片作为检测分样品（如0.5g～1.0g），在液氮中充分研磨，回温后按比 例加人样品提取缓冲液继续研磨（通常1：10）。 把研磨后的样品转移到5mL离心管中，8000r/min离心5min，上清液作为DAS-ELISA和IC RT-PCR检测提取液。 注：提取液在3h内使用，否则保存在4℃中。 4.3RT-PCR检测样品的制备 称取表现症状的0.1g叶片、种子等样品在液氮中充分研磨后，提取RNA。 5检测与鉴定 5.1DAS-ELISA检测 DAS-ELISA检测应设置对照，用健康的植物组织作阴性对照，用感染BPMV的植物组织作阳性对 照，用样品提取缓冲液作空白对照。其中，阴性对照的种类和材料（如种子或叶片）应该尽量与所检测样 品相一致。 具体操作过程见附录B。当使用商业性检测试剂盒时，参照试剂盒说明进行操作。 5.2RT-PCR检测 RT-PCR检测应设置对照，用健康的植物组织作阴性对照，用感染BPMV的植物组织作阳性对照， 用ddH20作空白对照。 具体操作过程见附录C。 5.3IC-RT-PCR检测 IC-RT-PCR检测应设置对照，用健康的植物组织作阴性对照，用感染BPMV的植物组织作阳性对 照，用ddH2O作空白对照。 具体操作过程见附录D。 5.4序列测定 将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者直接测序，测序可由生物公司完成。把测序所得到的核 苷酸序列与已知的BPMV相应序列进行比对，如果与已知的BPMV相应序列相一致则判定为BPMV， 不一致则判定为非BPMV。 6结果判定与记录 6.1结果判定 当DAS-ELISA检测结果呈阳性、同时IC-RT-PCR或RT-PCR检测结果呈阳性时，则判定为 检出BPMV； 2