SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2328—2009 化妆品急性毒性的角质细胞试验 Cosmetics acute toxicity of keratinocyte cytotoxicity test 行业标准信息服务平台 2009-07-07发布 2010-01-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2328—2009 前 言 本标准附录A、附录B和附录D是规范性附录，附录C是资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫 局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：程树军、许崇辉、焦红、温巧玲、秦瑶、邱璐、郑秋月。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 SN/T2328—2009 化妆品急性毒性的角质细胞试验 1范围 本标准规定了化妆品急性毒性的角质细胞试验方法的基本原理、试验准备、试验过程、结果和报告。 本标准适用于化妆品原料和成品细胞毒性作用的筛选和检测。 本标准适用于预测啮齿类动物急性经口毒性试验的开始剂量，可作为毒性试验的一部分，结合其他 试验用于受试物质毒性的整体评价 本标准也可作为制药、农业和工业受试物质，食品添加剂和接触材料，以及其他污染物的毒性测定 参考方法。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2. 1 希尔函数 hillfunction 关于受试物浓度与反应关系的包含4个变量的S型对数数学模型。 Top-Bottom Y是反应，X是剂量（或浓度）对数，Bottom是最小反应，Top是最大反应，logICso是反应剂量或浓 度在最高（Top）和最低（Bottom）中间时的对数，HillSlope表示曲线的倾斜度。 2.2 人角质细胞humankeratinocyte，HKC 角质细胞是构成人体表皮的主体细胞，是一种可合成角蛋白的细胞，体内呈分层生长排列；体外分 离的角质细胞来源于包皮或胸腹部等处皮肤组织。 2.3 20%致死浓度IC20 在一定条件下使HKC细胞生长和活力抑制20%的受试物浓度。 2. 4 半数致死浓度IC50 在一定条件下使HKC细胞生长和活力抑制50%的受试物浓度 2.5 80%致死浓度IC80 在一定条件下使HKC细胞生长和活力抑制80%的受试物浓度。 3基本原理 本标准采用正常人角质细胞，应用中性红摄取（NRU）细胞毒性试验检测受试物的细胞毒性。体外 培养的正常哺乳动物细胞不断地分裂增生，毒性物质不论其作用位点和机制如何，都会干扰细胞的分裂 增殖过程，导致细胞生长速率下降和数量减少。培养中的正常细胞经受试物暴露后，细胞毒性表现为浓 度依赖性的中性红摄取降低，据此可以得出有关细胞完整性受损和生长抑制等作用的信息。中性红 （NR）是一种弱的阳离子染料，极易以非离子扩散方式穿透细胞膜并在细胞溶酶体内聚集。活细胞具有 结合和连接中性红染料的特点。外源性物质作用引起的细胞膜表面的改变或溶酶体膜敏感性的改变， 1 SN/T2328—2009 引起溶酶体膜脆性增高及其他的变化，并逐渐不可。这些变化导致细胞吸收和连接NR的能力下降， 这样就有可能区分活的、损伤的或死亡的细胞。角质细胞NRU细胞毒性检测程序是基于这一原理设 计的一种反映细胞存活/活力变化的检测方法。 4试验准备 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸水或超纯水，本标准列出了特殊试验材料的建议厂 家，如有证据证明，可以使用替代品。 4.1人角质细胞 人角质细胞可用原代或细胞系： a）人永生化角质细胞系HaCaT：商品化细胞系，可从美国标准生物品收藏中心（AmericanType Culture Collection,ATCC)获取； b）正常人角质细胞（NormalHumanKeratinocyte，NHK）：商品化细胞系，可从美国BioWhittak er公司（CloneticsCC-2507或CC-2607）获取； c）原代人角质细胞（PrimaryHumanKeratinocyte）：来源于儿童皮肤（包皮环切术）或成人皮肤， 需符合有关伦理学规定。由实验室自行制备。 4.2细胞培养基 4.2.1人角质细胞无血清基础培养基 商品化购置或实验室自行配制，可从美国BioWhittaker公司KBM（KeratinocyteBasalMedium）或 GIBCO公司K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium)获取。 4.2.2人角质细胞培养基补充试剂 配制角质细胞完全培养基需补充以下活性成分：重组人表皮生长因子（EGF）、胰岛素（Insulin）、氢 化可的松（Hydrocortisone）庆大霉素、两性霉素和牛垂体提取物（BovinePituitaryExtract，BPE）。配 2.0mL。上述补充试剂也可以由供应商提供试剂盒，如美国BioWhittaker公司（Clonetics，CC-4131）。 4.2.3人角质细胞血清培养基 建议用无血清培养基培养角质细胞： a）角质细胞系（HaCaT)血清培养基：90mLMEM基础培养基，10mLFCS、1mL非必需氨基酸、 50U/mL青霉素、50g/mL链霉素； （DMEM：F12/3：1），含有腺嘌岭（24.3g/mL），表皮生长因子（10ng/mL），转铁蛋白 （5μg/mL），氢化可的松（0.4μg/mL），胰岛素（100U/mL），青霉素（100U/mL），链霉素 (100μg/mL)。 4.2.4人角质细胞无血清完全培养基 500mL人角质细胞无血清基础培养基（KBM或K-SFM），添加以下成分：0.0001ng/mL人重组 EGF，5μg/mL胰岛素，0.5μg/mL氢化可的松，30μg/mL庆大霉素，15ng/mL两性霉素，30μg/mL牛 垂体提取物。添加165μL氯化钙溶液，钙终浓度为0.10mmol/L。完全培养基保存在2℃～8℃，不超 过2周。 4.2.5人角质细胞冻存培养基 MEM基础培养基，含20%FCS、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、10%DMSO。 4.3细胞培养试剂 4.3.1胎牛血清（FCS)：国产优质或进口，56℃加热灭活30min。 4.3.2小牛血清：国产优质或进口。 2