SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 20802008 栋树猝死病菌检疫鉴定方法 Identification of Phytophthora ramorum Werres,De Cock & Man in't Veld 行业标准信息服务平台 2008-04-29发布 2008-11-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2080—2008 前言 本标准附录A、附录B、附录C和附录D为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。 本标准起草人：吴品珊、严进、廖太林、巫燕。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 SN/T 2080—2008 栎树猝死病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了植物检疫中栎树猝死病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于针对栎树猝死病菌寄主的苗木、原木、树皮、枝条、枝叶等植物部分及其土壤和介质， 以及木材、木包装和木制品的人境检疫。 2原理 2.1分类地位 英文名：pathogen of sudden oak death,pathogenof ramorumleaf blight 学名:PhytophthoraramorumWerres,DeCock&Manin'tVeld 栎树猝死病菌（Phytophthoraramorum），也称多枝疫霉，属真菌界（Fungi），卵菌门（Oomycota）卵 菌纲（Oomycetes），腐霉目（Pythiales），腐霉科（Pythiaceae），疫霉属（PhytophthoradeBary）。 Phytophthoraramorum可侵染多种林木和花卉植物，造成栎树等树木猝死（SuddenOakDeath，筒 称SOD），以及杜鹃、荚等花卉枝叶枯菱（TwigBlightofRhododendron）。 病菌在世界上的分布和寄主植物参见附录A和附录B。 2.2鉴定原理 根据栎树猝死病菌在寄主上的为害症状、形态学特性、巢式PCR特异性扩增片段作为鉴定依据。 3仪器和用具 3.1仪器 3.1.1生物显微镜，体视显微镜。 3.1.2光照生物培养箱。 3. 1. 3 高压灭菌器。 3.1.4高速离心机。 小准信息服务平台 3.1.5PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪。 3.2用具 3.2.1 塑料盒。 3.2.2黑光灯（18W,320nm~380nm)。 3.2. 3 塑料研杆，移液器。 4试剂和培养基 4.1试剂 4.1.1琼脂粉，V8液，胡萝下，杜鹃叶片。 4.1.250%匹马霉素，氨青霉素钠盐，利福平钠盐，五氯硝基苯，碳酸钙。 4.1.3SDS，Tris-HCI,氯化镁，盐酸，EDTA，氢氧化钠，乙酸钠，氯化钾，Tris，CTAB，TBE，无水乙醇， 苯酚，溴化乙锭（EB)，三氯甲烷，异丙醇，异戊醇。 4.1.4蛋白酶K,Taq聚合酶,dNTP,DNA分子量Marker(100bp)。 4.1.5巢式PCR引物Phyto1/Phyto4,Phyto2/Phyto3。 1 SN/T 2080—2008 4.2培养基 4.2.1选择性培养基PARP-V8 50mL过滤后的V8液，17g琼脂，950mL蒸馏水，灭菌后冷却到50℃，加人在50%的匹马霉素 0.01g、氨苄青霉素钠盐0.25g、利福平钠盐0.01g和五氯硝基苯0.05g（可按比例在二甲基亚砜中溶 解后加入）。 4.2.2胡萝卜丝培养基CPA 50g胡萝卜切丝，22g琼脂，1000mL蒸馏水，灭菌。 4.2.3V8 培养基 V8液体100mL，加人2.5g碳酸钙，15g琼脂，蒸馏水900mL，灭菌。 5鉴定方法 5.1症状检查 检验苗木时，主要查验枝梢和叶部。杜鹃花等花卉植物症状为叶片上有黑褐色病斑，茎部有凹陷溃 疡斑，枝梢和叶常出现枯萎。检验栎树等原木木材时，重点查验溃疡斑。溃疡凹陷或平坦，常有暗红至 黑色的粘性流胶渗出，树皮内部组织褪色，坏死区域的边缘有黑环围绕。取有疑似症状的植物的叶、枝、 树皮、根等植物部分做分离培养。 土壤和栽培介质也是传播病菌的主要途径，检验时收集被携带进境的土壤和栽培介质，做诱集 试验。 5.2分离培养和诱集 5.2.1植物组织和木材的分离培养 取植物组织或木材上的病健交界处（无明显症状的取靠近地下部的组织）5mm10mm，0.5%次 氯酸钠消毒2min～5min，在选择性培养基PARP-V8和胡萝卜丝培养基CPA上，20℃~22℃黑暗培 养1周～2周。如有白色真菌菌落出现，可转人V8培养基上20℃12h光照/12h黑暗培养。 5.2.2土壤和栽培介质的诱集 塑料盒中放入土壤或介质，加入2倍体积的无菌双蒸水，将数张健康的杜叶片（国内市场上杜 品种即可）流水冲洗干净，滤纸吸干水分，叶面朝上漂放在水上，盖上盒盖，15℃12h光照/12h黑暗培 养。3d后开始检查，取有失绿或水浸状斑的叶片，切取病健交界处，在胡萝卜丝培养基20℃～22℃黑 暗培养1周～2周。 5.3分子生物学鉴定 5.3.1DNA提取 将有疑似症状的植物叶片、枝条、茎，以及分离出的菌丝，按CTAB法提取DNA（参见附录C)。 5.3.2巢式PCR检测 P.ramorum首轮PCR特异性引l物Phyto1和Phyto4序列分别为5-CATGGCGAGCGCTTG A-3',5'-GAAGCCGCCAACACAAG-3',第2轮引物Phyto2和Phyto3的序列分别为5'-AAAGCC AAG CCC TGC AC-3 ,5'-GGT GGA TGG GGA CGT G-3'。 25μL的反应体系有样品DNA5μL，10XPCRbuffer2.5μL，25mmol/L氯化镁4μl，10mmol/L dNTPs0.5μL,5μmol/LPrimers1.25μL/1.25μL,5U/μLTaq聚合酶0.25μL,双蒸水10.25μL。 反应条件为94℃85s-→93℃35s、62℃55s、72℃50s，35个循环-→72℃10min。 在0.5XTBE电泳缓冲液中，1.5%琼脂糖凝胶电泳，5V/cm，0.5%EB染色20min，凝胶成像仪分 析结果。 必要时做荧光PCR检测（参见附录D）。 2