SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2342—2009 苹果茎沟病毒检疫鉴定方法 Quarantine identification of apple stem grooving virus 行业标准信息服务平台 2009-07-07发布 2010-01-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2342—2009 前言 本标准的附录B、附录C和附录D为规范性附录，附录A为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局，中华人民共和国宁波出人境检验检疫 局，中国检验检疫科学研究院，石河子大学，中华人民共和国北京出入境检验检疫局，中华人民共和国黑 龙江出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：郭立新、段维军、向本春、梁新苗、陈红运、陈文炳、邵碧英、邓丛良、刘洪义、 朱水芳。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 2342—2009 苹果茎沟病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了植物检疫中苹果茎沟病毒（Applestemgroovingvirus）的检疫鉴定方法。 本标准适用于苹果、梨等的苗木、其他繁殖材料中苹果茎沟病毒的检疫鉴定。 2原理 2.1学名与分类地位 学名：Applestemgroovingvirus 缩写：ASGV 分类地位：发形病毒属（Capillovirus)的代表种；尚未划分到特定的科。 2.2传播方式 参见附录A。 2.3抗原特性 具有中等免疫原性，属内不同种病毒之间无血清学关系，与纤毛病毒属（Trichovirus）的苹果褪绿 叶斑病毒（Applechloroticleaf spotvirus）粒子形态类似，但在血清学上不相关。 2.4病毒基因组 基因组为6496nt的正义单链RNA，含有2个ORF，其中ORF1编码产生一个241kDa的多聚蛋 该病毒MP基因和 CP基因相对保守，且CP基因的保守性更强。 2.5鉴定依据 根据苹果茎沟病毒具有中等免疫原性、可以制备病毒抗血清，CP基因保守性强、可以设计引物和 探针等特点，双抗体夹心酶联免疫吸附反应、逆转录-聚合酶链式反应及实时荧光RT-PCR反应可以作 为检疫工作中检疫鉴定该病毒的依据 3试剂和溶液 3.1酶联免疫检测试剂：见附录B第B.1章。 3.2总RNA提取试剂：Trizol Reagent。 3.3 RT-PCR一步反应法试剂:Ready-to-GoRT-PCRBea 3. 4 三氯甲烷。 3.5 异丙醇。 3.6 75%乙醇。 3.7 无水乙醇。 3.8 无RNase水：经0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）处理的双蒸水或商品无RNase水 3.9逆转录酶及其缓冲液 3.10 核糖核酸酶抑制剂。 3.11 dNTPs:含 dATP,dCTP,dGTP,dTTP。 1 SN/T 2342—2009 3. 12 氯化镁（MgClz）。 3.13 DNA聚合酶及其缓冲液。 3.14琼脂糖：电泳纯。 3.15 5漠化乙锭。 3.16 DNA Marker:100 bp~2 000 bp。 3. 17 50XTAE缓冲液：见C.1.1。 3. 18 上样缓冲液：见C.1.2。 仪器和材料 4.1研钵。 4.2 电子天平（感量0.001g）、普通天平（感量0.1g）。 4.3 冷冻离心机、小型瞬时离心机。 4. 4 常温冰箱、低温冰箱（一40℃）。 4.5 超低温冰箱（一80℃）。 4.6 制冰机。 4.7 涡旋振荡器。 4.8 磁力搅拌器。 4. 9 高压灭菌锅。 4. 10 pH计。 4. 11 PCR仪。 4.12 实时荧光PCR仪。 4.13 微波炉。 4.14 电泳仪。 4.15 电泳槽。 4.16 凝胶分析成像系统。 4. 17 酶联检测仪。 4.18 微量可调移液器：2μL20μL、200μL、1000μL、5000μL。 4.19 无RNase吸头：10μL、20μL200μL、1000μL、5000μL。 准信息服务平 4.20 无RNase离心管：1.5mL。 4.21 PCR反应管：200μL。 5 检疫鉴定方法 5.1 双抗体夹心酶联免疫吸附反应 按附录B中规定的试验方法进行试验。 5.2普通RT-PCR检测 每个反应体系设置两个平行反应。检测时以含有病毒目标片段的质粒或受苹果茎沟病毒侵染的昆 诺藜叶片RNA作为阳性对照，以未含该病毒的植物组织RNA作为阴性对照，以水代替模板作为空白 对照。按附录C中规定的试验方法进行试验。 5.3实时荧光RT-PCR检测 每个反应体系设置两个平行反应。检测时以含有病毒目标片段的质粒或受苹果茎沟病毒侵染的昆 诺藜叶片RNA作为阳性对照，以未含该病毒的植物组织RNA作为阴性对照，以水代替模板作为空白