SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1961.17—2013 出口食品过敏原成分检测 第17部分：实时荧光PCR方法 检测羽扇豆成分 Detection of allergen components in food for export- Part 17:Real time PCR method for detecting lupin components 业标准信息服务平台 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1961.17—2013 前言 SN/T1961《出口食品过敏原成分检测》共分为19部分： 第1部分：酶联免疫法检测花生成分； 第2部分：实时荧光PCR法检测花生成分； 第3部分：酶联免疫吸附法检测养麦蛋白成分； 第4部分：实时荧光PCR方法检测腰果成分； 第5部分：实时荧光PCR方法检测开心果成分； 第6部分：实时荧光PCR方法检测胡桃成分； 第7部分：实时荧光PCR方法检测胡萝卜成分； 第8部分：实时荧光PCR方法检测榛果成分； 第9部分：实时荧光PCR方法检测杏仁成分； 第10部分：实时荧光PCR方法检测虾/蟹成分； 第11部分：实时荧光PCR方法检测麸质成分； 第12部分：实时荧光PCR方法检测芝麻成分； 第13部分：实时荧光PCR方法检测小麦成分； 第14部分：实时荧光PCR方法检测鱼成分； 第15部分：实时荧光PCR方法检测芹菜成分； 第16部分：实时荧光PCR方法检测芥末成分； 第17部分：实时荧光PCR方法检测羽扇豆成分； 第18部分：实时荧光PCR方法检测养麦成分； 第19部分：实时荧光PCR方法检测大豆成分。 本部分为SN/T1961的第17部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草， 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共 和国江苏出人境检验检疫局。 服务平台 本部分主要起草人：陈颖、张舒亚、祝长青、李妮、张佳谊、吕蓉、李想、徐宝梁 SN/T 1961.17—2013 出口食品过敏原成分检测 第17部分：实时荧光PCR方法 检测羽扇豆成分 1范围 SN/T1961.17的本部分规定了食品中过敏原羽扇豆成分的实时荧光PCR检测方法。 本部分适用于食品及其原料中过敏原羽扇豆成分的定性检测。 本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为0.01%（质量分数）。 2夫 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3. 1 过敏原allergen 又称致敏原或变应原，是指能够引起变态反应的抗原。 信息服务 3.2 过敏原羽扇豆成分cashewallergeningredient 本文件中过敏原羽扇豆成分即指羽扇豆特异性DNA片段。 3. 3 实时荧光PCRrealtimePCR 3. 4 Ct 值cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 4方法提要 样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用羽扇16SrRNA和18SrRNA内部转录间隔区核苷 酸特异片段特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象，判断样品 中是否存在过敏原羽扇豆成分。 1 SN/T 1961.17—2013 5试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB6682的要求。所有试剂均用 无DNA酶污染的容器分装。 5.1检测用引物（对)序列和探针 羽扇豆成分扩增引物和探针、内参照（真核生物成分）引物和探针详见表1。 表1试验用引物和探针 名称 序列（5"-3"） 目的基因 TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA 内参照5端引物 AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 内参照3°端引物 真核生物18SrRNA基因 FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC 内参照探针 C-TAMRA 羽扇豆5端引物 CCTCACAAGCAGTGCGA 18S-26S核糖体内转录间 羽扇豆3端引物 TTGTTATTAGGCCAGGAGGA 隔区（ITS) 羽扇豆探针 FAM-CCCCTCGTGTCAGGAGGCGC-TAMRA 5.2CTAB缓冲液:55mmol/LCTAB,1400mmol/LNaCl,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris 用10%盐酸调pH至8.0，121℃，高压灭菌20min，备用。 5.3 TE缓冲液(Tris-Cl、EDTA 缓冲液):10 mmol/L Tris-HCI(pH 8.0),1 mmol/L EDTA(pH8.0)。 行业标准信息服务 5. 4 蛋白酶K：20mg/μL。 5.5J RNA酶溶液：5μg/μL。 5.6 Tris 饱和酚。 5.7 三氯甲烷。 5.8 异戊醇。 5.9 异丙醇。 5. 10 70%乙醇。 5.11 Taq DNA 聚合酶。 5.12dNTP混合液。 5.13 10×PCR 缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl(pH 8. 4),200 mmol/L KCl,15 mmol/L MgCl2 。 6 仪器和设备 6. 1 实时荧光PCR仪。 6.2 离心机：最大离心力≥16000g。 6.3 微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL。 6.4 冰箱:2℃~8℃,-20℃。 6.5 高压灭菌器。 6.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.7 pH计。 2