SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1961. 8—2013 出口食品过敏原成分检测 第8部分：实时荧光PCR方法检测 榛果成分 Detection of allergen components in food for export- Part 8:Real time PCR method for detecting hazelnut components 业标准信息服务平台 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1961.8—2013 前言 SN/T1961《出口食品过敏原成分检测》共分为19部分： 第1部分：酶联免疫法检测花生成分； 第2部分：实时荧光PCR法检测花生成分； 第3部分：酶联免疫吸附法检测养麦蛋白成分； 第4部分：实时荧光PCR方法检测腰果成分； 第5部分：实时荧光PCR方法检测开心果成分； 一 第6部分：实时荧光PCR方法检测胡桃成分； 第7部分：实时荧光PCR方法检测胡萝卜成分； 第8部分：实时荧光PCR方法检测榛果成分； 第9部分：实时荧光PCR方法检测杏仁成分； 第10部分：实时荧光PCR方法检测虾/蟹成分； 第11部分：实时荧光PCR方法检测麸质成分； 第12部分：实时荧光PCR方法检测芝麻成分； 第13部分：实时荧光PCR方法检测小麦成分； 第14部分：实时荧光PCR方达检测鱼成分； 第15部分：实时荧光PCR方法检测芹菜成分： 第16部分：实时荧光PCR方法检测芥末成分； 第17部分：实时荧光PCR方法检测羽扇豆成分； 第18部分：实时荧光PCR方法检测养麦成分； 第19部分：实时荧光PCR方法检测大豆成分。 本部分为SN/T1961的第8部分 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归门。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共 和国山东出入境检验检疫局。 本部分主要起草人：张霞、赵良娟、高宏伟、张海英、刘培、张宏伟、高旗利、陈颖、袁飞、吴亚君、 郑文杰、吴冬雪。 I SN/T 1961.8—2013 出口食品过敏原成分检测 第8部分：实时荧光PCR方法检测 榛果成分 1范围 SN/T1961的本部分规定了食品中过敏原榛果成分的实时荧光PCR检测方法。 本部分适用于食品及其原料中过敏原榛果成分的定性检测。 本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为0.01%（质量分数）。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3定义和术语 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 过敏原allergen 又称致敏原或变应原，是指能够引起变态反应的抗原。 3. 2 榛果hazelnut 别名又称山板栗、尖栗、捶子等，属桦木科（Batulaceae）棒属（Corylus）植物。 3.3 实时荧光PCR realtimePCR 在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。 3. 4 Ct 值cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4方法提要 样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用榛果oleosin基因序列的特异性检测引物和探针 进行实时荧光PCR扩增，根据Ct值，判断样品中是否存在过敏原榛果成分。 5试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB6682中一级水的规格。所有试剂 1 SN/T 1961.8—2013 均用无DNA酶污染的容器分装。 5.1检测用引物（对）序列和探针 榛果成分扩增引物和探针、内参照（真核生物成分）引物和探针详见表1。 表1试验用引物和探针 名称 序列（5"-3"） 目的基因 内参照5端引物 TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA 真核生物 内参照3端引物 AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 18SrRNA基因 内参照探针 FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-TAMRA 榛果5'端引物 CCCCGCTGTTTGTGATAT 榛果oleosin 榛果3°端引物 ATGATAATAAGCGATACTGTGAT 基因 榛果探针 FAM-TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT-Eclipse 5.2CTAB缓冲液:55mmol/LCTAB,1400mmol/LNaCl,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris, 用10%盐酸调pH至8.0，121℃，高压灭菌20min，备用。 5. 3 TE缓冲液(Tris-Cl、EDTA缓冲液):10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。 5.4 蛋白酶K：20mg/μL。 5.5 RNA酶溶液：5μg/μL。 Tris饱和酚。 5.6 5.7 三氯甲烷。 5.8 异戊醇。 5. 9 异丙醇。 5. 10 70%乙醇。 5. 11 TaqDNA聚合酶， 5. 12 dNTP混合液。 10×PCR缓冲液:200mmol/LTris-HCl(pH 8. 4),2000mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2。 5. 13 标准信息服务平台 仪器和设备 6. 1 实时荧光PCR仪。 6.2 离心机：最大离心力≥16000g。 6.3 微量移液器：10μuL、100μL、200uL、1000μL。 6.4 冰箱：2℃~8℃，-20℃。 6. 5 高压灭菌器。 6.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.7 pH计. 6.8 天平：感量0.01g。 检验步骤 7.1DNA提取 7. 1. 1 称取300mg已制备好的样品于2mL离心管中，加入600uLCTAB缓冲液和40μL 蛋白酶K，振荡混勾，65℃30min，期间每隔10min振荡混匀； 2