SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1579—2005 椰子致死黄化植原体检测方法 Determination of coconut lethal yellowing phytoplasma 行业标准信息服务平台 2005-05-20发布 2005-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1579—2005 前言 本标准的附录A、附录B和附录C均为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国海南出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：李伟东、李继勇、张宁。 本标准为首次发布的出人境检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 I SN/T1579—2005 椰子致死黄化植原体检测方法 1 范围 本标准规定了植物检疫中椰子致死黄化植原体的检疫检测方法。 本标准适用于植物检疫中棕榈科植物（包括种果、苗木等繁殖材料）椰子致死黄化植原体的检疫 检测。 2原理 2.1椰子致死黄化植原体 学名:Coconut Lethal Yellowing Phytoplasma 缩写：CLYP 分类地位：原核生物界（Prokaryiotes）；软壁菌门（Tenericute）；软球菌纲（Mollicutes）：植原体属 (Phytoplasmata)。 2.2寄主范围 椰子（Cocosnucifera）、轮羽椰（Allagopteraarenaria）、香枕榔（Arenguengleri）、糖棕（Borassu flabellifer）、Arikuryroba schizophylla、短穗鱼尾葵（Caryotamitis），Caryotarumphiana、散尾葵 （Chrysalidocarpuslutescens）长柄贝叶棕（Coryphaelata），环羽椰（Dictyospermaalbum）三角椰 （Dypsisdecaryi），油棕（Elaeisguineensis），Gaussiaattenuata，卷叶豪威椰（Howeabelmoreana）、棍棒 椰（Hyophorbeverschaffeltii）彩叶棕属（Lataniaspp，）、蒲葵（Livistonachinensis）、圆叶蒲葵（Livis tonarotundifolia），中东矮棕（Nannorrhopsrichiana）、加那利枣椰（Phoenircanariensis），枣椰（P. dactylifera）、非洲枣椰（P.reclinata）、岩枣椰（P.rupicola）、橙枣椰（P.sylvestris）、Pritchardiaaffi- nis、太平洋棕（P.pacifica）、P.remota、国王椰（P.thurstonii）、Raveneahildebrandtii、棕榈（Trachy- carpusfortunei）、圣诞椰（Veitchiamerrillii）、瓦努阿图圣诞椰（V.montgomervana）。 2.3寄主症状 椰子幼树症状：主要表现为黄叶以及矛叶和心部的坏死。 结果树症状：成熟前椰果脱落；开放或未开放的佛焰苞花序坏死；旗叶先变成黄褐色，然后由下往上 褪绿变黄；矛叶和心部腐烂；树冠倒；根系腐烂。 2.4地理分布 北美洲：美国（佛罗里达州和得克萨斯州）、墨西哥。 中美洲和加勒比海地区：开曼群岛、巴哈马、古巴、牙买加、海地、苏里南、多米尼加、伯利兹、洪都 拉斯。 非洲：加纳、多哥、尼日利亚、贝宁、坦桑尼亚、肯尼亚莫桑比克、喀麦隆、莫桑比克。 2.5植原体形态特征 椰子致死黄化植原体形态为近球形、椭圆形、圆筒形、念球状、丝状等多种形态，它们常处于二均分 裂状态，其大小为0.42μm～2μm，最长的为念球状可达16μm以上。 2.6传播途径 田间主要通过昆虫介体传播，昆虫介体主要是蜡蝉（MynduscrudusVanDuzee）。染病种苗的转运 等人为途径使得植原体远距离传播。 2.7组织病理学特性 受植原体感染的植物材料组织经DAPI染色后，能在显微镜下直接观察到韧皮部筛管细胞中植原 1 SN/T1579—2005 体特异的DNA荧光光点。 2.8分子生物学特性 以染色体DNA为基础的分子生物学技术已用来检测和鉴定植原体。根据16SrRNA基因保守序 列设计通用引物和植原体椰子致死黄化组16SrIV特异性引物，应用PCR技术进行检测。 3仪器设备、用具及试剂 3.1仪器设备 PCR扩增仪、多功能电泳仪、冷冻高速离心机、紫外光透视仪、震荡器、冰箱、水浴锅、透射式电子显 微镜、电子分析天平（感量0.1mg）、超薄切片机、生物研究显微镜等。 3.2用具 头、刀片、Eppendorf管、研钵等。 3.3试剂 PCR检测试剂（见附录A)、OAPI检测试剂（见附录B)、电镜观察试剂（见附录C)。 4检验方法 4.1症状检查 仔细观察椰子和其他棕榈科植物种苗或结果植株，症状描述见2.3。 4.2PCR检测 对采集的植物样品进行PCR检测，方法见附录A。 4.3DAPI检测 对采集的植物样品进行DAPI检测。方法见附录B。 4.4植原体形态观察 对采集的植物样品制备超薄切片，通过电镜观察植原体形态。方法见附录C。 5结果判定 样品DAPI检测到韧皮部筛管细胞中特有的荧光反应，或电镜超薄切片在韧皮部筛管细胞中存在 大量植原体，或PCR检测表现为阳性，均可判定供检测的样品存在椰子致死黄化植原体。 6样品保存与复核 6.1样品保存 检测结果表现阳性的植物样品液氮干燥后于一80℃下保存。保存样品做好登记和标记工作。 6.2结果记录与资料保存 完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验人员 的签字。DAPI检测荧光结果照片，电镜观察植原体形态特征照片，PCR检测电泳阳性结果照片。 6.3复核 由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性 和真实性，必要时进行复核实验。 2