SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1400—2004 甘蔗流胶病菌检疫鉴定方法 Methods for the quarantine and identification of Xanthomonas axonopodis pv vasculorum(Cobb1894)Vauterin,Hoste,Kerster &Swings1995 行业标准信息服务平台 2004-06-01发布 2004-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1400—2004 前言 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广西出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：张君潮、黄胜光、叶盛华、文新。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 I SN/T1400—2004 甘蔗流胶病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了进境植物检疫中甘蔗流病菌的检疫和鉴定方法 本标准适用于进境甘燕蔗茎、甘蔗叶片中甘燕流胶病菌的检疫和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T4789.28—1994食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 3原理 甘蔗流胶病菌属于原核生物总界细菌界（Procaryotes），薄壁细菌门（Gracilicutes），假单胞杆菌科 nopodispv.vasculorum），可侵染甘蔗的叶片和蔗茎，形成条斑和流胶症状。该菌引起的甘蔗流胶病有 明显的症状，病原菌有独特培养性状和生理生化特征。病害的症状、病原菌的形态、病原菌的培养、生理 生化性状以及致病性测定是鉴定甘蔗流胶病菌的依据。 4仪器和用具 4.1仪器 生物显微镜、生物培养箱等。 4.2用具 高压灭菌器、普通天平、超净工作台、酒精灯、培养皿、试管、载玻片、盖玻片、接种针或缝纫针、接种 环、移液器、小刀、剪刀、镊子、玻璃棒等。 5培养基和试剂 5.1YPGA培养基配方：酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，蛋白陈10g/L，琼脂15g/L，pH7.2。 5.2 YDC培养基配方：酵母膏10g/L，D-葡萄糖20g/L，碳酸钙20g/L，琼脂15g/L，pH7.2。 5.3GYCA培养基配方：酵母膏5g/L，葡萄糖5g/L，碳酸钙40g/L，琼脂15g/L。 5.4明胶、升汞液（氯化汞12g，蒸馏水80mL，浓盐酸16mL）。 5.5磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸钠、硝酸钠。 5.6蛋白陈、磷酸氢二钾、七叶苷、柠檬酸铁。 5.7牛肉浸膏、氯化钠、琼脂、可溶性淀粉。 5.8产酸产气及利用碳源、氮源试验用试剂：木糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、纤维 二糖、甘油、麦芽糖、鼠李糖、菊粉、水杨苷、甘露醇、山犁醇、半乳糖醇、阿东糖醇、α-甲基-D葡萄糖苷溶 天冬酰胺。 1 SN/T1400—2004 5.9灭菌水。 6现场检疫 在现场检疫时，应仔细检查蔗茎、蔗叶有无病变症状，如发现黄色至白色纵条纹且在叶尖处较多的 叶片，或切口有黄色至橙色的胶状团块、蔗节上维管束变红色的蔗茎等流胶病可疑症状时，应取样作实 验室鉴定。 在产地检疫和隔离试种期间，还要注意检查有无生长矮小或生长点死亡的植株，当发现可疑症状应 取样作实验室鉴定。 7实验室鉴定 7.1病原菌分离纯化 7.1.1分离纯化 发现菌脓的蔗茎或蔗叶，直接在无菌操作条件下将菌脓用无菌水制成分离用悬液，用YPGA培养 基加胆盐进行稀释分离，置培养箱内27℃～28℃条件培养3d～7d。然后再进行一次至二次的纯化，最 后获得纯菌株。 7.1.2保湿培养 将怀疑有症状而没有菌脓流出的蔗茎砍断，栽植于湿透细砂中，或将怀疑有症状的叶片切断，置于 湿润的容器中。置于27℃～28℃条件下培养4d~6d，在横切面上见到流出菌脓后用7.1.1方法获得 纯菌株。 7.2病原菌形态观察及生理生化测定 7.2.1形态观察 对分离纯化获得的纯菌株，经染色制成玻片，在显微镜下观察形状，测量大小。 7.2.2菌落颜色和粘液的形成 待测菌在GYCA或YDC培养基上划线培养，置培养箱内27℃～28℃条件下培养3d～7d，观察菌 落的颜色和粘液的形成。 7.2.3鞭毛染色法 按GB/T4789.28—1994中2.7规定的方法进行。 7.2.4革兰氏染色法 按GB/T4789.28—1994中2.2规定的方法进行 7.2.5明胶液化试验 在培养血中倒人15mL新鲜配制和灭菌的加了0.4%明胶的营养琼脂培养基凝固后，在表面点接 或单划线。27℃培养72h，用5mL～10mL的酸性升汞液浸没培养基表面。清晰的带表示明胶液化为 阳性反应。 7.2.6淀粉水解试验 培养基：蛋白陈5g，牛肉浸膏3g，氯化钠5g，琼脂15g，可溶性淀粉20g，水1000mL。 将前4种成分加热溶化于500mL水中，另将淀粉溶于25mL水中，将两液混合、补加水至1L、调 至pH7.0，于115℃灭菌15min。倾注灭菌平血或在灭菌前分装试管，灭菌后制成琼脂斜面。亦可用牛 肉浸汤琼脂加人淀粉代替本培养基。 称取碘片1g和碘化钾2g，放烧瓶中，加少量水、以玻棒研拌，使碘片完全溶解，再加水至300mL， 制成碘试剂，移装棕色试剂瓶中，保存于冰箱，避免光线照射。 以18h～24h的纯待测菌，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养 2