SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1467—2004 小鹅瘟病毒分离和琼脂免疫扩散 试验方法 Method of virus isolation and agar-gelimmunodiffusion test for gosling plague 行业标准信息服务平台 2004-11-17发布 2005-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1467—2004 前言 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：李超美、罗朝科、朱雪良、刘学辉、王成龙。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 I SN/T1467—2004 小鹅瘟病毒分离和琼脂免疫扩散 试验方法 1范围 本标准规定了小鹅瘟病毒分离和琼脂免疫扩散试验方法。 本标准适用于病毒分离鉴定和小鹅瘟病毒抗体的检测。 2病毒分离 2.1材料准备 2.1.1仪器设备 超净工作台、普通离心机、小型孵化箱或培养箱、灭菌剪刀、镊子、三角烧瓶、玻璃研磨器、离心机、吸 管(1 mL2mL、5mL,10 mL)。 2.1.2试剂 2.1.2.1蒸馏水。 2.1.2.2PBS液（见第A.1章）。 2.1.2.3青霉素、链霉素（见第A.2章）、三氯甲烷（分析液）。 2.1.2.4SPF鹅胚或番鸭胚。 2.2病料及处理 2.2.1取病料 取可疑小鹅瘟病维鹅或死亡维鹅，无菌操作取肝、胰、脾、肾、脑等内脏器官病料放置灭菌的玻璃瓶 冻结保存（一20℃）作为病毒分离。 2.2.2初步处理 先将病料组织剪碎、研磨，用灭菌PBS液作1：51：10稀释，经3000r/min离心30min，取上清 液加入青霉素和链霉素，使之各含1000IU/mL，置37℃温箱中30min，经细菌检验为阴性者作为病毒 分离材料。 2.3胚胎接种 2.3.1鹅胚接种 将上述病毒分离材料通过尿囊腔分别接种6枚12日龄易感鹅胚，每胚0.2mL，置37℃~38℃孵化 箱内继续孵化，每天照胚2次～4次，观察9d，一般经5d～7d大部分胚胎死亡。弃去48h以内死亡的 胚胎，收集48h以后死亡的鹅胚，放置4℃～8℃冰箱内冷却收缩血管。无菌操作吸取尿囊液保存和作 无菌检验，并观察胚胎病变。无菌的尿囊液冻结保存（一70℃）作传代及检验用。 2.3.2番鸭胚接种 将上述病毒分离材料接种6枚12日龄易感番鸭胚，每胚尿囊腔接种0.2mL，置37℃~38℃孵化箱 内继续孵化，每天照胚2次～4次，观察9d，一般经5d～9d大部分胚胎死亡。弃去48h死亡的胚胎， 收集48h以后死亡的番鸭胚，放置4℃～8℃冰箱内冷却收缩血管。无菌操作吸取尿囊液保存和作无菌 检验，并观察胚胎病变。无菌的尿囊液冻结保存（一70℃）作传代及检验用。 2.3.3胚胎病变 趾、胸部毛孔、颈、喙旁均有较严重出血点，胚肝充血及边缘出血，心脏和后脑出血，头部皮下及两肋皮下 1 SN/T 1467—2004 水肿。接种后7d以上死亡的鹅胚和番鸭胚胚体发育停顿，胚体小。 2.4病毒鉴定 本标准使用琼脂扩散试验来做小鹅瘟病毒鉴定，方法见3.1.6和3.2.2。 3琼脂扩散试验 3.1材料准备 3.1.1试剂 氯化钠、硫柳汞、优质琼脂粉、三氯甲烷、聚乙二醇（MW20000）。 3.1.2器材 注射器、离心机、天平、透析袋、振荡器、金属打孔器（孔径6mm，孔距4mm）、吸管、量筒、玻璃平血 （100X15mm）、三角烧瓶和模板纸（见图1）。 d) 图1琼扩试验结果判定示意图 3.1.3诊断试剂 3.1.3.1标准抗原由生产商提供，按说明书使用。 3.1.3.2标准阳性血清由生产商提供，按说明书使用。 3.1.3.3标准阴性血清由生产商提供，按说明书使用。 3.1.4被检血清制备 翅静脉采血，常规分离血清，并按0.01%量加人硫柳汞防腐，可在4℃保存5d或冻结保存待检。 3.1.5被检鹅卵卵黄的处理 用注射器（不带针头）吸取20mL新鲜鹅卵黄于盐水瓶中，加人等量生理盐水充分振荡均匀，再加 2