SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1465—2004 西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法 Methods of quarantine and identification of Acidovorax avenae subsp. citrulli 行业标准信息服务平台 2005-04-01实施 2004-11-17发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1465—2004 前言 本标准的附录A、附录B为规范性附录，附录C为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准由中华人民共和国新疆出人境检验检疫局负责起草，南京农业大学参加起草。 本标准主要起草人：张祥林、薛光华、胡白石、张伟、范伟功、余永杰。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 I SN/T1465—2004 西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了植物检疫中西瓜细菌性果斑病菌（Acidovoraaavenaesubsp.citrulli，简称A.a.c)的 鉴定方法。 本标准适用于对瓜类植物种子中的西瓜细菌性果斑病菌的鉴定。 2原理 细菌性果斑病(Bacterial FruitBlotch)是西瓜、甜瓜等葫芦科作物上的一种危险性病害，此病的病 原菌为西瓜细菌性果斑病菌[Acidovoraxavenaesubsp.citrulli（Schaad，Sowell,Goth，Colwelland Webb1978）Willems，Goor，Thielemans，Gillis，KerstersandDeLey1992VP，该菌属原核生物界 （Procaryotae）、薄壁菌门（Gracilicutes）、暗细菌纲（Scotobacteria）、假单孢菌科（Pseudomonadaceae）、嗜 酸菌属（Acidovorac）。该病菌的形态特征、生物学特性、生化特性、寄主范围、传播途径，以及PCR特异 性反应等特征是该检疫鉴定方法的依据。 3仪器和用具 3.1生物显微镜（具照相系统）。 3.2超净工作台。 3.3电子天平（感量1/10000）。 3.4光照恒温培养箱。 3.5恒温振荡培养箱。 低温冰箱。 3.6 3.7 高压灭菌器。 3.8 培养皿（直径：7.5cm）。 3.9恒温水浴锅（30℃~95℃）。 3.10高速冷冻离心机（18000r/min以上） 乐准信息服 3. 11 小型电动粉碎机。 3.12 PCR仪。 3.13电泳装置（电泳仪、水平电泳槽）。 3.14 PCR管(0.2mL)。 3.15离心管(12mL、2mL、1.5mL)。 4主要试剂 蛋白陈、琼脂粉、甘油、升汞、盐酸、次氯酸钠、二甲基对苯二胺盐酸盐、酵母膏、葡萄糖、牛肉浸膏、酚 红、小碱、羧甲基纤维素、硼酸、亮甲酚蓝、溴甲酚紫、乙醇、放线菌酮、羧苄青霉素、乙二胺四乙酸 （EDTA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸钠（SDS）、液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、琼脂糖 （Na2HPO4：12H2O）、磷酸二氢铵（NHH2PO4）、硫酸镁（MgSO4·7H2O）、氯化钙（CaCl·7H2O）、氯 1 SN/T1465—2004 化钠（NaCI)、氯化钾（KCI)、10XPCR缓冲液（10mmol/LTris-HCl,10mmol/LKCI)、10XdNTP液 (2. 5 mmol/L dATP,dTTP,dCTP,dGTP)。 5检疫鉴定方法 5.1种植观察 将待测的瓜类种子种植于温室或实验室内的育苗钵（纸杯或塑料杯）中，每一育苗钵中种植2粒种 子，每份种子样品种植5000粒左右，最低不少于3000粒种子，生长环境温度为25℃～35℃，相对湿度 大于等于70%，种子出苗后15d内观察幼苗发病情况。如果种植期间有发病幼苗，且表现出西瓜细菌 性果斑病苗期的典型症状（见附录A），则采集可疑病株进行分离培养及常规检测，或直接用病叶提取核 酸作PCR检测。 5.2分离培养 5.2.1种子中病原菌的分离培养 分别称取待测瓜类种子样品各100g，分装于干净纸袋中，做好标记，供检测用。无菌操作下，将供 试样品置于0.1%升汞溶液中表面消毒30s~80s（也可用含有效氯1%的次氯酸钠溶液表面消毒2min~ 4min），无菌水清洗三次，然后将种子移至无菌的小型电动粉碎机中，破碎种子，将处理好的种子装入一 灭菌的广口瓶中，加入200mL灭菌的0.1mol/L磷酸钠缓冲液，混匀，25℃下过夜，次日用该溶液在事 先制备好的金氏B平血培养基上划线，每一样品做三个血，28℃恒温培养48h。A.a.c在金氏B培养 基上生长的菌落呈淡白色、光滑、不粘稠，无荧光。 5.2.2病叶中病原菌的分离培养 用灭菌剪刀剪取病叶上的病斑，用含有效氯1%的次氯酸钠溶液中表面消毒50s～60s，无菌水清 洗三次，然后将其移至灭菌培养血中，加5滴～10滴无菌水，用灭菌镊子将病斑夹碎，使病组织液溶于 无菌水中。用灭菌的移植环蘸取该液，在金氏B平血培养基上划线，每一处理做三个皿，28℃恒温培养 48 h。 5.3氧化酶反应测定 无菌操作下，在一个无菌培养血中放一张灭菌滤纸，滤纸上加5滴现配的1%二甲基对苯二胺盐酸 盐溶液，挑取生长24h的菌苔涂在滤纸上，若测试菌株的菌苔在20s内变成红色或紫色则为阳性反应， A,a,c标准菌株呈阳性反应；若菌苔颜色不变则为阴性反应。 5.4高温培养 将供试菌株的菌落在金氏B平皿培养基上划线，每一处理做两个皿，40℃恒温培养48h，观察细菌 生长情况。A.a.c标准菌株在40℃下可以生长，而该菌的几个近似种在40℃下不能生长。 5.5半选择性培养基培养 将供试菌株分别在BFB-08、TWZ和EBB等半选择性培养基所制备的平血培养基上划线，每一处 理做三个皿，28℃恒温培养48h。A.a.c标准菌株在BFB-08培养基上产生红褐色、凹陷、光滑的菌落， 在TWZ培养基上产生深红色、光滑、球形凸起的菌落，在EBB培养基上产生淡蓝色、光滑菌落。各种 半选择性培养基配方见附录B。 5.6致病性测定 将待测菌株在金氏B培养基上培养48h左右，配成10°cfu/mL～10%cfu/mL的细菌悬浮液，用喷 雾法接种在预先培育的、具2片～3片真叶的健康西瓜或甜瓜幼苗上，每一菌株接种3株～5株，用无菌 三天开始观察发病情况，第十天结束，每天观察一次。A.a.c标准菌株可形成附录A所描述的症状。 5.7PCR法检测（可选择项目） 从分离培养的细菌菌株中提取核酸，或从表现典型症状的病叶中提取核酸，进行PCR检测和电泳 分析。以提取的供试菌株或病叶的核酸为模板DNA，用A.a.c标准菌株的核酸作阳性对照，用非 2