猴志贺氏菌检验操作规程 Protocol of examination for shigella in monkeys SN /T 1168—2002 前言 本标准在参考国内、国外实验室的检验规程和总结了实践经验制定的。本标准的附录A、附 录B为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：董俊、杨建明、肖荣海、杨晶焰、赵颜润。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 1 范围 本标准规定了猴志贺氏菌的检验方法。 本标准适用于猴志贺氏菌的检验。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后 所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议 的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标 准。 GB4784.5一1994食品微生物学检验志贺氏菌检验 GB4789.28一1994食品微生物学检验染色法、培养基和试剂 GB/T6682一1992分析实验室用水规格和试验方法（二级水） 信息服务平台 3设备和器材 3.1温箱。 3.2天平。 3.3显微镜。 3.4无菌棉拭子。 3.5接种棒、铂金丝。 3.6载玻片。 3.7灭菌平皿。 3.8灭菌试管、试管架。 3.9三角烧瓶。 3.10酒精灯。 3.11硝酸纤维素滤膜：150mm×50mm，0.45um。临用时切成两张，每张70mm×50mm，用铅 笔划格，每格6mm×6mm。每行10格，分6行。灭菌备用。 4培养基和试剂 4.1缓冲甘油盐水保菌液：见附录A。 4.2Cary-Blair运送培养基：见附录A。 4.3革兰氏阴性杆菌增菌液（GN)：按GB4789.28一1994中4.17规定。 4.4沙门氏一志贺氏琼脂培养基（SS）：按GB4789.28一1994中4.22规定。 4.5麦康凯琼脂培养基：按GB4789.28一1994中4.24规定。 4.6三糖铁（TSI)琼脂培养基：按GB4789.28一1994中4.26规定。 4.7葡萄糖半固体管：按GB4789.28—1994中4.31规定。 4.8半固体管：按GB4789.28—1994中4.30规定。 4.9葡萄糖铵琼脂：按GB4789.28一1994中3.8规定 4.10尿素琼脂：按GB4789.28—1994中3.15规定。 4.11西蒙氏柠檬酸盐琼脂：按GB4789.28一1994中3.5规定， 4.12氰化钾（KCN）培养基：按GB4789.28一1994中3.16规定。 4.13氨基酸脱羟酶试验培养基：赖氨酸、鸟氨酸及对照培养基：按GB4789.28一1994中3.12规 定。 义务平台 4.14糖发酵管：棉子糖、甘露醇、甘油、七叶苷及水杨苷：按GB4789.28一1994中3.2规定。 4.155%乳糖发酵管：按GB4789.28一1994中4.32规定 4.16蛋白陈水、靛基质试剂：按GB4789.28一1994中3.13规定。 4.17志贺氏菌属诊断血清：由指定单位提供。 5检疫程序 见附录B。 6操作步骤 6.1采样、运输和保存 6.1.1将灭菌棉拭子用增菌液或生理盐水湿润后直肠采样或采集新鲜粪便，浸入GN增菌液或直接 接种在SS和麦康凯琼脂平板上。 6.1.2样品采集后如需延迟至4h以上方能送检的，可保存于缓冲甘油盐水保菌液或Cary-Blair 培养基中。Cary-Blair运送培养基只能保存72h；缓冲甘油盐水保菌液仅用于志贺氏菌属培养的 粪便样品保存，效果不如运送培养基，液体变酸（黄色）后不可再用。 6.2增菌 将GN增菌液置36℃土1℃培养4h～8h。培养时间视细菌生长的情况而定。当培养液出现轻 微混浊时即应终止培养。 6.3分离和初步生化试验 6.3.1取增菌液或用所采样品直接划线于SS和麦康凯琼脂培养基上，于36℃土1℃培养18h～24 h。志贺氏菌在以上培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。 6.3.2在SS和麦康凯琼脂平板上挑取可疑菌落，接种三糖铁培养基和葡萄糖半固体管各1管。一 般应多挑几个菌落，以防遗漏。经36℃土1℃培养18h～24h，分别观察结果。 6.3.3.1在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物。 6.3.3.3在三糖铁琼脂培养基上18h～24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物（三糖铁琼脂培养基斜面 变为黄色）。 6.3.3.4在三糖铁琼脂培养基上产气的培养物。 6.3.3.5凡在三糖铁琼脂培养基上乳糖、蔗糖不发酵、葡萄糖产酸不产气（福氏志贺氏菌六型可 产生少量气体）、葡萄糖半固体管上无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。 6.3.3.6葡萄糖半固体管上不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物。 6.4血清学分型和进一步生化试验 6.4.1血清学分型 挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。用志贺氏菌多价血清做凝集试验，如果由于 《抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再做凝集试验；如果出现凝集，则用相对应的单价 血清作玻片凝集试验，作出判断，如果出现福氏志贺氏菌单价血清呈现凝集反应的，参照表1判 定是否是福氏志贺氏菌。 表1福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原 在因子血清中的凝集 型和亚型 型抗原 群抗原 3, 4 6 7.8 la 1 1, 2, 4, 5, 9...... + 1b 1 1, 2, 4, 5, 9...... + + 2a II 1, 3, 4...... + 2b II 1, 7, 8, 9...... + 3a III 1, 6, 7, 8, 9...... + + 3b III 1, 3, 4, 6...... + + 4a IV 1, (3, 4)..... (+) 4b IV 1, 3, 4, 6...... + + 5a V 1, 3, 4...... 十 5b V 1, 5, 7..... + 6 VI 1, 2, (4)..... (+) x变体 一 1, 7, 8, 9...... + Y变体 1, 3, ..... + 注：+凝集； 一不凝集；（）有或无 6.4.2进一步生化试验 在做血清型分型的同时，应做进一步生化试验，即葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、赖氨酸和鸟 氨酸脱羧酶、pH7.2尿素、氰化钾生长、以及水杨苷和七叶苷的分解。除宋内氏菌和鲍氏13型为 鸟氨酸阳性外，志贺氏菌的培养物均为阴性结果。必要时还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验， 志贺氏菌应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型 血清发生凝集，仍不能判定为志贺氏菌属的培养物。 已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵，甘露醇、棉子糖和甘油的发酵和 靛基质试验。志贺氏菌属四个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。见表2。 表2志贺氏菌属4个群的生化特性 生化群 5%乳糖 甘露醇 棉子糖 甘 油 靛基质 A群：疾志贺氏 VL (+) 一/+ 菌 B群：福氏志贺氏 (+) + 菌 C群：鲍氏志贺氏 (+) -/+ 菌 D群：宋内氏志贺 + / (+) + d 氏菌 注：+阳性； 一阴性； 一／+多数阴性、少数阳性；（+）迟缓阳性：d有不同的生化型。 7结果报告 综合生化和血清学的试验结果判定菌型并报告。 (规范性附录） 培养基的配制 A.1缓冲甘油盐水保菌液