SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1142—2011 代替SN/T1142—2002,SN/T1377—2004 马病毒性动脉炎检疫技术规范 Quarantine protocol for equine viral arteritis 行业标准信息服务平台 2011-05-31发布 2011-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1142—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1377—2004《从精液中分离马病毒性动脉炎病毒试验操作规程》和SN/T1142—2002 《马病毒性动脉炎微量血清中和试验操作规程》。 本标准与SN/T1142—2002和SN/T1377—2004相比，主要的技术变化如下： 增加了血液、组织中的病毒分离； -增加了酶联免疫吸附试验方法； 增加了荧光RT-PCR试验方法 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：梁成珠、朱来华、郑小龙、李西峰。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1142—2002; SN/T1377—2004。 行业标准信息服务平台 I SN/T 1142—2011 马病毒性动脉炎检疫技术规范 1范围 本标准规定了马病毒性动脉炎的病毒分离鉴定、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验和荧光RT PCR试验等方法。 本标准适用于进出境马属动物病毒性动脉炎的诊断和检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489—2008实验室生物安全通用要求 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 RK-13:兔肾细胞 PBS:磷酸盐缓冲生理盐水 CPE：细胞病变反应 EAV：马病毒性动脉炎病毒 TCIDso：半数组织感染量 ELISA：酶联免疫吸附试验 RealtimeRT-PCR：荧光反转录-聚合酶链式反应 标准信息 4临床诊断 4.1临床特征 发病马的临床症状表现不一，一般为发热，精神沉郁，食欲不振，流鼻液，流泪，结膜炎，眼脸水肿，额 下淋巴结肿大，白细胞减少，四肢特别是后肢下端水肿，雄马阴囊及包皮肿胀，妊娠马流产。老龄雌马和 营养状况差的马临床症状较重，妊娠马比空怀雌马症状明显。如果妊娠马群发生EAV流行，流产率可 高达40%~59%。 4.2判定 根据4.1临床检查可作出初步判定，确诊需进行实验室检测。 1 SN/T 1142—2011 5病毒分离鉴定 5.1仪器设备 超净工作台或生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、液氮贮存罐、蔡氏滤器和微孔滤膜 （0.22um）、高压灭菌锅、离心机、超声波破碎仪、微量细胞培养板（96孔）、微型振荡器、微量可调移液器 （200uL）、电子天平、细胞瓶和吸管（1mL、2mL、5mL、10mL）等。 5.2试剂与材料 MEM培养基、抗生素贮存液、细胞消化液、细胞培养液和细胞维持液、1%细胞染色液、7.5%羧甲 基纤维素、红细胞裂解液、磷酸盐缓冲液（PBS）、兔肾细胞（RK-13）、马病毒性动脉炎病毒（EAV)标准病 毒株（Bucyrus株）和各种常规试剂等，试剂配制见附录A。 5.3样品采集与处理 5.3.1样品采集与运送 无菌采集动物抗凝全血（不宜用肝素作抗凝剂），死胎或活产马驹的脑、心、肺、肝、肾、脾和淋巴结等 组织，公马可采集精液。采集的样品应立即放人冰盒中，尽快运送到实验室。如果不能及时送往实验 室，组织样品冷冻于一20℃以下保存（抗凝全血样品4℃保存）。 5.3.2样品处理 5.3.2.1全血样品的处理：取抗凝血加入2倍3倍体积红细胞裂解液，混匀静止4min～5min，待红 则重复上述步骤，直到红细胞除尽）。加人PBS缓冲液，制成白细胞悬液，反复冻融两次，低温（一20℃） 保存备用。 5.3.2.2动物组织样品的处理：无菌处理样品，样品称量，置于无菌容器内，加人少量维持液，用灭菌研 槌研磨，制备成组织悬液，再加培养液，制成终浓度为10%的组织悬液。以2000r/min离心10min， 收取上清液低温（一20℃）保存备用 5.3.2.3动物精液的处理：将精液超声波裂解三次（300w），每次15s；然后在4℃下2000r/min离心 10min，沉淀精子细胞，取上清液低温（-20℃）保存备用。 5.4病毒分离 5.4.1将上述上清液或细胞悬液用维持液作倍比稀释，无菌接种于已长成单层的RK-13细胞瓶或细 胞培养板上，每个滴度接种两瓶或两孔。同时设立细胞对照和阳性对照，单层细胞仅加维持液作细胞对 照，用60倍稀释的标准病毒接种作阳性对照。 5.4.2加盖摇匀使之均匀分布于整个细胞层，置于5%二氧化碳培养箱中37℃吸附1h。 5.4.3加人含0.75%羧甲基纤维素的培养液，置于5%二氧化碳培养箱中37℃继续培养，每日在显微 镜下观察细胞病变（CPE)情况（细胞圆缩、脱离、裂解）。 5.4.4如果不出现CPE，应盲传2代～3代，即将细胞培养物冻融两次，再接种到单层细胞培养5d～ 7d后，用细胞染色液（工作液为0.1%福尔马林缓冲结晶紫溶液）染色。观察细胞单层是否细胞壁不完 整的死细胞区域。 5.5结果判定 检查各种对照试验，细胞对照正常，无CPE；阳性对照出现明显的CPE，说明试验成立。如果试验 2