ICS 65.020.99 SN B 16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1135.10—2013 马铃薯V病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of potato virus V 行业标准信息服务平台 2013-08-30发布 2014-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1135.10—2013 前言 SN/T1135共分为10部分： 第1部分：马铃薯癌肿病检疫鉴定方法； 第2部分：马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法； 第3部分：马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法； 第4部分：马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法； 第5部分：马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法； 第6部分：马铃薯排腐病菌检疫鉴定方法； 第7部分：马铃薯A病毒检疫鉴定方法； 第8部分：马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法； 第9部分：马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法； 第10部分：马铃薯V病毒检疫鉴定方法。 本部分为SN/T1135的第10部分。 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出人境检 验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：李彬、闻伟刚、栗智平、田永蕾、吴翠萍、栗寒、刘洪义、王秀芬、李明福。 行业标准信息服务平台 I SN/T1135.10—2013 马铃薯V病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了马铃薯V病毒检疫鉴定的基本原则和方法。 本标准适用于所有进出境种薯、商品用薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质和番茄等茄科作物中可能 带有马铃薯V病毒的检疫鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法 3原理 3.1马铃薯V病毒学名与分类地位 学名：PotatovirusV 缩写：PVV 分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）。 3.2检疫鉴定依据 标准信息服 马铃薯V病毒的血清学特性、分子生物学特性和病毒粒体形态是检疫鉴定的主要依据。 该病毒的相关资料参见附录A。 4 仪器设备、用具及试剂 4.1主要仪器设备 酶联检测仪、洗板机、高速冷冻台式离心机、PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪·水平电泳槽，凝胶 成像仪、水浴槽、透射电子显微镜、天平（感量：0.001g）等。 4.2主要用具 研钵和研棒、各种量程的可调移液器（2μL，10μL，20μL，100uL，200μL，1000μL）、各种吸头 (10μL，200μL，1000μL）、96孔酶标板、离心管（0.2mL,0.6mL，1.5mL）等。 4.3主要试剂 主要酶联测定试剂见附录B，反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测试剂见附录C，实时荧光RT PCR检测试剂见附录D,生物学测定试剂参见附录E。 1 SN/T1135.10—2013 5样品制备 的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。对采集的叶片进行酶联免疫吸附测定、RT 材料直接进行检测。 6检测与鉴定 6.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA） 将制备的样品上清液加人已包被PVV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测。设置阳性 对照、阴性对照和空白对照，其中以样品提取缓冲液为空白对照，阴性对照（如叶片或块茎等）为健康的 植物组织，阳性对照为含有PVV的植物组织。检测中，每个样品和对照均需设置两次重复。具体操作 见附录B。 6.2RT-PCR检测 分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。设置阳性对照、阴性对照 和空白对照，其中以超纯水为空白对照，阴性对照和阳性对照的设置见6.1。具体操作见附录C。 6.3实时荧光RT-PCR检测 样品总RNA提取后，采用一步法进行实时荧光RT-PCR扩增，即反转录过程和实时荧光PCR在 同一个PCR管中进行。阳性对照、阴性对照和空白对照的设置见6.2。具体操作见附录D。 6.4免疫电子显微镜观察 见 SN/T1840。 6.5生物学测定 具体操作参见附录E。 7 结果判定 DAS-ELISA检测结果为阳性，RT-PCR检测结果或实时荧光RT-PCR检测结果为阳性，可判定待 检样品带有马铃薯V病毒。必要时，可采用免疫电子显微镜观察方法或生物学测定方法进行辅助 鉴定。 8样品与结果记录保存 8.1样品保存 经鉴定确定携带马铃薯V病毒的检测样品应在合适的条件下保存，病株在一20℃或者超低温冰箱 中保存，做好标记和登记工作，以备复核。 2