SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1135.5—2007 马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法 Identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus 行业标准信息服务平台 2007-12-24发布 2008-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1135.5—2007 前言 SN/T1135共分为五个部分： 马铃薯癌肿病检疫鉴定方法； 一马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法； 马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法； 一马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法； 马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法。 本部分是SN/T1135的第5部分。 本部分的附录B、附录C均为规范性附录，附录A为资料性附录。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：赵文军、陈红运、梁新苗、张乐、朱水芳、魏梅生。 本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 SN/T1135.5—2007 马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法 1范围 SN/T1135的本部分规定了马铃薯环腐病菌的检疫鉴定方法。 本部分适用于所有进出境马铃薯种薯及商品用薯的检疫和鉴定。 2术语和定义 下列术语和定义适用于SN/T1135的本部分。 2. 1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 在固相支持物上（酶联板）包被细菌特异性抗体，加入待测样品后，再用酶标记的细菌抗体进行免疫 2.2 PCR 以耐热DNA聚合酶和一对引物（与待测目标核酸分子序列同源的DNA片段）通过高温（DNA分 子变性）和低温（引物和目标核酸分子复性并被耐热DNA聚合酶延伸）交替循环扩增待测目标核酸分 子的方法。 3原理 （Firmibacteria）棒形杆菌属（Clavibacter），依靠病薯进行远距离传播。寄主及世界分布参见附录A。 4仪器和用具 4.1仪器设备 PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温 冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、酶标仪。 4.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。PCR缓冲液、氯化镁（MgCl,）、dNTPs（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP）、TaqDNA聚合酶、引物和探针、牛肉汁、酵母膏、磷酸氢二钾（K,HPO,）、磷酸二氢钾 （KH,PO,）、硫酸镁（MgSO,）、葡萄糖、琼脂，酶联检测试剂见附录B。 5病菌的鉴定 5.1症状检查 取样品量1%～5%（若样品少可适量增大比例）的块茎进行检查。将块茎横切，检查环腐病菌侵染 症状，挤压块茎，检查维管组织是否浸解。发病轻者维管束变黄，呈不连续的点状变色，重者整个维管束 环变色。病菌也可侵害块茎维管束周围的薄壁组织，呈环状腐烂，严重时可引起皮层与髓部组织分离， 轻轻挤压块茎从维管束中涌出奶酪样的柱状物。块茎表面的症状在轻度危害时不明显，随病害发展，皮 色变暗或变褐，严重时表皮可出现裂缝。 5.2双抗体夹心酶联免疫吸附测定 利用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法对样品进行初筛（见附录B），若检测结果为阳性，需进行病原 1 SN/T 1135.5—2007 菌的分离培养及5.4方法测定。 5.3病原菌的分离培养 5.3.1培养基的制备 营养肉汤酵母膏培养基（NBY)：牛肉汁8.0g，酵母膏2.0g，磷酸氢二钾（K,HPO)2.0g磷酸二 氢钾（KH,PO)0.5g，葡萄糖2.5g，琼脂15.0g，水1L，灭菌后加1mL过滤灭菌的1mol/L硫酸镁 （MgSO）溶液 5.3.2块茎中病原菌的分离培养 马铃薯块茎洗净后用75%乙醇表面消毒5min，从带病薯块的维管束挑取少量菌脓在NBY培养基 上划线或从带病块茎的维管束圈切取少量病组织，在灭菌水中捣碎制成悬浮液，用接菌环蘸菌悬液划 线，经两次纯化培养后转入培养基斜面。 5.4PCR凝胶电泳检测 见附录C。 6结果判定 若酶联免疫检测结果为阳性，可初步判定为检出马铃薯环腐病菌，需利用5.4方法进一步检测 环腐病菌。 7样品保存与复核 7.1样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出马铃薯环腐病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备 复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。 7.2菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为马铃薯环腐病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于NBY培养基斜 面上，28℃培养48h，然后4℃冰箱保存，或液体培养至对数生长期，加人20%灭菌甘油并混匀，一80℃ 长期保存或用安管冷冻干燥长期保存。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。 7.3结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签字。若酶联免疫方法需有酶联反应的原始数据，PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。 7.4复核 由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责，主要考察实验记录、照片等资料的完整性和 信息服务平台 真实性，必要时进行复核实验。