进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法PCR方法 Identification of bovine, sheep and goat derived materials in import animal derived feedstuff PCR method SN/T 1119—2002 前言 本标准的附录A、附录B为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国进出口商品检验技术研究所、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和 国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：徐宝梁、杨宝华、王静、曹际娟、薄清如。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 引言 牛海绵状脑病、痒病均可通过食用病畜组织传播，所以含牛羊源性成分的动物源性饲料的使用，一直被认为 是牛海绵状脑病、痒病得以传播的主要途径。禁止疫区含牛羊源性成分的动物源性饲料的生产、流通和使用，也 就成为防止牛海绵状脑病、痒病感染、流行的主要手段。 根据牛羊遗传物质的特异性，应用PCR方法，可以检测动物源性饲料中牛羊源性成分。本方法的测定低限为 0.125%。 1范围 本标准规定了进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测的抽样、制样、PCR方法、限制性内切酶酶切反应方 法。 本标准适用于动物源性饲料中牛羊源性成分的定性检测。 2术语、定义和缩略语 下列术语、定义和缩略语适用于本标准， 2. 1 含有动物成分的饲料。 2. 2 牛源性成分bovinederivedmaterial 牛特异性DNA片段。 2.3 羊源性成分sheepandgoatderivedmaterial 羊特异性DNA片段。 2. 4 聚合酶链式反应polymerase chain reaction 聚合酶链式反应，简称PCR。使用两段(20个～24个核苷酸）寡核苷酸作为反应的引物，这两段寡核苷酸引物 的序列应不发生互补作用。但它们可和称为模板的待测DNA两条链上在一定的位点分别发生互补。反应液由包括 含有镁离子的反应缓冲液、4种单核苷酸（dNTP）、模板DNA及引物。在DNA聚合酶催化下，通过温度的变化DNA变 性、退火及延伸）而合成两个互补位点之间的DNA片断。这样的反应反复进行，使第一个循环产生的DNA片断得以 扩增。经25个～30个循环，扩增倍数达106。 2.5缩略语 PCR：polymerase chain reaction，简称PCR。 DNA：deoxyri60nucleicacid，脱氧核糖核酸。 dNTP：deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷酸三磷酸。 dATP：deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸。 dcTP：deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸。 dGTP：deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸。 dTTP：deoxythymidinetriphosphate，脱氧胸苷三磷酸。 dUTP：deoxyuridinetriphosphate，脱氧尿苷三磷酸。 UDG：uracilDNAglycosylase，尿嘧啶DNA-糖基酶。 bp：basepair，碱基对。 BSA：bovine serum albumin，牛血清白蛋白。 EDTA：ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸。 Taq：Thermus aquaticu，水生栖热菌。 Tris：tris(hydroxymethyl)aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷。 TE：Tris-CI、EDTA缓冲液。 GuSCN：guanidinium isothiocyanate，异硫氰酸胍 准信息服务平台 Triton X-100：t-octylphenoxypolyethoxyethanol，辛基苯氧基聚乙氧乙醇。 3抽样和制样 3.1检验批 以不超过200t为一检验批，简称批。 同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格、等 3.2抽样数量 3.2.1袋装饲料 按式(1)计算抽样袋数： 区 式中： N一全批袋数； a一抽样袋数。 注：a值取整数，小数部分向前进位为整数 3.2.2散装饲料 根据散装单位的大小和类型，一般可从上、中、下三层的中心及四角五点抽样；或分层随机采样，取样点不 少于15处。 3.3抽样工具 3.3.1金属单管抽样器：全长65cm～75cm，槽口长50cm~55cm，口宽1cm~1.8cm，头尖形，最大外径约 2.5cm，或其他等效抽样器。 3.3.2取样铲 3.3.3分样器。 3.3.4样品袋t可密封。 3.4抽样方法 3.4.1袋装饲料 将扦槽向下，从每袋一角依斜对角方向插入袋内，然后将扦槽旋转向上，抽出扦样器。每袋取样量不少于 500 g。 每批所抽取的样品总量不少于4kg。 3.4.2救装饲料 分层定点采样，每点取样量不少于500g。 每批所抽取的样品总量不少于4kg。 3.4.3实验童样品制备 合并所取样品，充分混匀，用分样器或按四分法缩样，至样品重约1000g。装入清洁容器内，加封后，标 明标记，及时送交实验室。 3.5试样制备 慈服务平台 从所取实验室样品中取出有代表性样品约500g，经粉碎机粉碎，过20目筛，混匀，均分成三份。分别装入 清洁容器内，加封后，标明标记。 3.6试样保存 试样于4℃下避光保存。 4测定方法 4.1方法提要 糖凝胶电泳检测PCR扩增产物：应用限制性内切酶酶切反应进行确证。 4.2试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。 4.2.1引物 4.2.1.1牛源性成分检测用引物（对)序列为： 5'-GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3 5'-GTAGGCTTGGGAATAGTACGA-3" 4.2.1.2羊源性成分检测用引物（对)序列为： 5'-TATTAGGCCTCCCCCTTGTT-3 5'-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3" 4.2.2TaqDNA聚合酶。 4.2.3限制性内切酶：DpnIl、sau3AI。 4.2.4 dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。 4.2.5琼脂糖：电泳纯。 4.2.6澳化乙锭。 4.2.7三氯甲烷。 4.2.8异丙醇。 4.2.970%乙醇。 4.2.10分子量标记：50bp~300bp。 4.2.11裂解液：5 mol/LGuSCN,0.05mol /LTris-盐酸(pH6.4)，0.02mol /LEDTA(pH8.0)，1.3%Triton X-100。 4.2.12TE缓冲液：10mmol/LTris-盐酸(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。 4.2.1310PCR缓冲液：100mmol/L氯化钾，160mmol/L硫酸铵，20mmolL硫酸镁，200mmol/Ltris-盐酸 (pH8.8),1%Triton X-100,1 mg/ mlBSA. 4.2.14电泳缓冲液：Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA（pH8.0)20mL，加蒸馏水至1000mL，使用时 10倍稀释。 4.2.15加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖。 服务平台 4.2.16酶切缓冲液：10mmolLTris-HC1(pH7.5)，10mmol/L氯化镁，50mmol L氯化钠，0.1mg/mL BSA. 4.3仪器和设备 4.3.1粉碎机。 4.3.2离心机。 4.3.3DNA热循环仪。 4.3.4电泳仪。 4.3.5 pH计。