橡胶南美叶疫病菌检疫鉴定方法 Methods for the quarantine and identification of south american leaf blight [Microcylus ulei (P.Henn.)Von Arx] in rubber tree SN/T 1106—2002 前言 橡胶南美叶疫病是我国进境植物检疫危险性病害。为了防止该病菌随寄主传人我国，需正确 掌握橡胶南美叶疫病菌的检疫鉴定方法。 本标准在制定过程中，分析了国内外有关资料，总结了多年来植物检疫经验，根据橡胶南美 叶疫病菌的形态学、生物学特性及植物病理学原理，确定各项鉴定技术指标。 本标准给出橡胶南美叶疫病菌的有性态和无性态的形态特征，以及在寄主上所表现的病征和 病状，鉴定时可以综合采取有性态和无性态的形态特征，或者其中的一个世代的形态特征作为鉴 定依据。 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准负责起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：林石明、余芳平、陈勇。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 1 范围 本标准规定了进境植物检疫中橡胶南美叶疫病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于进境三叶橡胶属（Hevea spp.）植物的芽条、芽穗、果等繁殖材料的橡胶南美 叶疫病菌的检疫鉴定。 2原理 橡胶南美叶疫病菌是活体营养真菌，可以侵染三叶橡胶的叶片、枝条、茎杆、花序、果， 造成橡胶树的持续落叶。该病菌有3种类型的繁殖体，即子囊孢子、器孢子和分生孢子。该病菌 可依据其极具扭曲的无性态的分生孢子特征，有性态的形态特征和生物学特征，以及在三叶橡胶 属植物上的症状特征进行鉴定。 3仪器、试剂 3.1手持式扩大镜。 3.2双目解剖镜（10×～50×）。 3.3显微镜（100×1000×）。 3.4切片机。 3.5小器具和器皿：刀片、解部刀、解部剪、侠子、记号笔、酒精灯或煤气灯、纱布、烧杯、 瓷杯、移植接种针、移植环、培养皿、烧杯、三角瓶、玻片、盖玻片、铝铂纸、Parafilm膜等。 3.6超净工作台。 3.7乳酚油：由苯酚（由水浴加热融化)20mL、甘油40mL、乳酸20mL、蒸馏水20mL混合配制而 成。 3.8次氯酸钠。 3.9酒精。 3.10琼脂。 4现场检疫 查验待检货物的有关单证，核实产地、包装、唛头、品名及数量。逐件检查橡胶树繁殖材料 的芽条、芽穗、果等是否有可疑疫情，重点应检查叶片。对于来自疫区的材料，还应仔细检查 装载交通工具和包装材料。然后，直接扦取有可疑症状的部位；如果没有发现任何可疑症状，则 按5%的繁殖材料比例扦取样品，带回实验室检查；如果样品数量少于10件，则全部扦取。 5检验方法 5.1症状检查 仔细检查橡胶的叶片、枝条、茎杆和朔果无其是嫩叶是否有橡胶南美叶疫病感病症状。该病 的病斑通常有半透明的榄绿色斑点，暗淡青灰色或发黑，穿孔。叶片卷曲，畸形，皱缩变黑呈火 烧状。病斑的背面灰白色，其上密生绒毛物（即分生孢子梗和分生孢子），病斑的四周轮生小黑点 （即分生孢子器或子座）。叶柄呈螺旋状扭曲。花序变黑、卷缩。枝条、茎杆坏死。果实上有隆起 的褐色病斑。在感病组织上，最常见是散生的分生孢子梗和其上所产生的分生孢子。 5.2病原菌检查 用解针挑取或刀片刮取病斑上的绒毛状物，制片，在显微镜下直接检查有无病菌的子实 体，记录其形态特征，必要时还应测量分生孢子梗和分生孢子的大小。在解部镜下检查可疑病斑 上的小黑点，切取带有病菌子实体的组织，用冰冻切片机或手工将组织切成厚度约为10μm～20μ m的薄片，制片，在显微镜下检查子囊壳和或分生孢子器，记录形态特征，并测量大小。 5.3分离培养 如果发现可疑症状，或没有发现该病菌的任何子实体，应采取分离、培养的方法作进一步鉴 定。直接刮取病斑上的分生孢子放入HMA培养基（参见附录A.2）培养，或选择新鲜病组织（叶片、 枝条或果的表皮组织），切成小块，用70%酒精消毒几秒钟后，置于3%次氯酸钠水溶液中消毒 5min～15min，再用灭菌水连续泡洗3次，用灭菌滤纸吸干水分后移置在HMA培养基平板上、于 四 24℃~28℃下培养。 6鉴定特征 6.1形态特征 6.1.1有性态 子囊壳阶段[Microcyclus ulei(P.Henn.)Von Arx in Muller&Von Arx；=Dothidella uleiP·Henn.；=Melanospsammopsisulei(P.Henn.)Stahell，属子囊菌门(Ascomycota)，座 囊菌目（Dothideales），小球腔菌科（Mycosphaerellaceae），小环座囊菌属（Microcyclus Saec.，Syd.&P.Syd.，1904）。其形态特征为：子座球形或近球形，碳质，表生于叶片或植物组 织上，通常聚生，有时着生于穿孔病斑的周围，直径200μm～450μum，但常侧面融合；拟薄壁组 织的细胞壁均匀加厚，色暗；子座内有一个至多个腔·成熟时具乳突状孔口。子囊壳散生，具乳 突状孔口，内径100um～200μum。子囊从腔的基部长出，有侧丝，双层壁，棍棒形，顶端稍厚， 大小为（50～80）μm×（12～16)μum，具8个近双行排列的子囊孢子。子囊孢子无色透明，单隔 膜，分隔处缢缩，近椭圆形，2个细胞不相等，较长的一端顶端较尖，朝下排列，大小为（12～ 20）μm×（2～5)μm。参见附录A之图A.1。 6.1.2无性态 该病菌有两种类型，一类是分生孢子器和器分生孢子，另一类只产生散生的分生孢子梗，其 上着生分生孢子。 6.1.2.1 橡胶离球壳菌（Aposphaeria uleiP.Henn.) 分生孢子器黑而发亮，碳质，圆形或椭圆形，表生，具乳突状孔口，直径为120μm160μ m，单腔，薄壁，由浅褐色、厚壁的角细胞组成外层，由更薄的、无色透明的小细胞组成内层， 孢子梗由分生孢子器的内壁细胞长出，无色透明，于基部分枝，丝状，大小为（12～20)μum×（2 ～3)μum。产孢细胞内壁芽殖，瓶梗型，聚生或离散生，无色透明，表面光滑。器孢子哑铃形， 直或稍弯，无色，常含2个～3个油滴，单胞，大小为（6～10)μm×（0.8～1)μm。 6.1.2.2大孢黑星孢（FusicladiummacrosporumKuyper) 黑星孢属（FusicladiumBonorden，1851）。其形态特征为：菌落散生，灰色，粉状。菌丝体埋 生。子座表生，由相当松散的细胞组成。分生孢子梗由表皮下的子座伸出，初为单胞，后期形成 多个隔膜而基部为亚球形膨大（宽约10um），由无色透明变成灰榄褐色，直或稍为弯曲，有时为 合轴状芽殖。分生孢子顶生，单生，直或弯曲，椭圆形或长梨形，初无色，后变成淡灰褐色，光 滑或具微小的疣突，通常具1个隔膜，偶而单胞。双细胞的分生孢子于分隔处缢缩；靠基部的细 胞较宽，基部截形、加厚，经常具有典型特征性的单向扭曲；其大小为：长（23～63）μum，平均 45μm，最宽处孢子的宽度（5～10）μm，平均8.5μm。单细胞的分生孢子大小为：（15～43）μm× (5～9）μum。分生孢子基部的孢痕宽为(2.5～4）μum。参见附录A之图A·2。 6.2培养特征 在HMA培养基上，菌落生长很慢，首先产生橄榄绿色的菌丝体，后形成淡黑色的、埋生或表 生的子座组织。表生的结构是大量的分生孢子器，并在子座的表面产生分生孢子；埋生的结构主 要是菌丝体和分生孢子，在培养基表面为橄榄绿色。培养26d后菌落直径为5mm～6mm。 6.3生物学特征 子囊孢子和分生孢子的最适萌发温度为24℃～28℃、最适pH值为7.8。在露水或雨滴中要8d 后萌发，产生附着胞、侵染菌丝，直接穿透叶片的角质层而侵入寄主植物组织，5d～8d后产生 症状。 7结果判定 以橡胶南美叶疫病菌在三叶橡胶属植物上产生的症状，有性态的子囊壳、子囊、子囊抱子以 及6.1.2.2所描述的分生孢子梗和分生孢子的形态特征为鉴定依据，进行综合判定。器孢子的特 征作为检疫鉴定的参考依据，不能单独作为鉴定的依据。 8检疫处理与样品保存 8.1检疫处理 如果检出橡胶南美叶疫病菌，则应对该批货物及其包装铺垫材料等全部进行销毁，并对交通 工具作消毒处理；如果没有检出橡胶南美叶疫病菌，则应将全批货物在隔离温室内作至少一个生 长周期的隔离试种、检疫观察。 8.2样品保存 发病的繁殖材料应及时销毁。可将病菌制成永久玻片，或培养物经过高温灭菌后保存。 附录A (资料性附录) 橡胶南美叶疫病菌的形态特征及HMA培养基 A.1橡胶南美叶疫病菌 橡胶南美叶疫病菌分为有性态（见图A.1)和无性态（散生的分生孢子梗和分生孢子，见图A· 2) 。 行业标准信息服务平台 1一子座; 2一子囊壳； 3一子囊， 4一子囊孢子。 图A.1橡胶南羹叶疫病菌的有性态