SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1311—2003 马尔堡病检测方法 Protocol of detecting methods for marburg disease 行业标准信息服务平台 2003-08-18发布 2004-02-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1311—2003 前 言 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：张鹤晓、刘环、刘艳华。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 I SN/T1311—2003 马尔堡病检测方法 1范围 本标准规定了马尔堡病检测方法。 本标准适用于马尔堡病抗体水平的检测。 2缩略语 下列缩略语适用于本标准。 2. 1 ELISA 1酶联免疫吸附试验。 2.2 IF免疫荧光试验。 2.3 MBG马尔堡病。 2. 4 PBS 磷酸盐缓冲液。 2. 5 TCIDs0 半数细胞感染量。 2. 6 CPE 细胞病变效应。 2.7 OD值 光密度值。 3原理 3.1IF试验 将感染MBG病毒的细胞固定在带圈的载玻片上，在特异性抗体存在时，利用抗原抗体反应具有高 度特异性这一特点，再加上荧光色素标记的二抗，与结合在抗原上的抗体结合，在荧光显微镜下呈现一 种特异性荧光反应。 3.2ELISA试验 将抗原包被在酶标板上，在特异性抗体存在时，抗原抗体结合，再加人酶标二抗，形成抗原抗体酶标 二抗复合物。复合物中的酶在遇到相应的底物时，催化底物分解，产生有色物质。根据有色物质的有无 及其浓度，间接推测抗体是否存在以及其效价。 4试剂和材料 试剂和材料的准备如下： MBG病毒：由指定单位提供； 包被用重组核蛋白抗原：由指定单位提供； 阴、阳性血清：由指定单位提供； 细胞抗原片：由指定单位提供或自制； 1 SN/T1311—2003 被检血清：用真空管采集血液，无菌分离血清，一20℃保存。用前60℃灭活1h； 酶标二抗：由指定单位提供； 底物溶液：由指定单位提供； 荧光素标记二抗：由指定单位提供； 细胞：Vero细胞； 细胞营养液、维持液、细胞分散液、包被液、洗涤液、稀释液、终止液、PBS的配制见附录A。 5器械和设备 器械和设备的准备如下： 荧光显微镜； 酶标仪； -96孔酶标板； 带圈载玻片； 单道和多道可调微量移液器20μL~200μL； 一温箱； 倒置显微镜； —冰箱。 6操作方法 6.1IF试验 6.1.1细胞抗原片的制备 将Vero细胞培养成单层，用无菌PBS洗一遍，接种104TCID5o/0.05mL～106TCID5o/0.05mL 量的MBG病毒，6d后，20%～40%感染细胞出现CPE，倒掉液体，用细胞分散液漂洗一次，加人细胞分 散液，37℃作用3min～5min，待细胞开始脱落前将分散液倒掉，（150mL细胞瓶）加人10mLPBS（含 5%特牛血清，防止细胞成团），用吸管用力吹打。取5mL细胞悬液加到直径10cm的平皿内，紫外线 照射20min灭活病毒，将细胞悬液稀释成1.2×105个细胞/mL，在带圈载玻片上每孔加0.015mL，保 证大多数细胞未感染，少部分细胞为带毒细胞。将载玻片空气干燥后，丙酮固定10min，放在塑料袋 内，°Co照射（200000rads），以消除病毒的传染性，后保存于一70℃备用。 以上步骤必须在生物安全IV级实验室内进行。 6.1.2正式试验 取出细胞抗原片，温至常温。将待检血清和阴、阳性血清用PBS作1：2、1：4、1：8等倍比稀释， 加到细胞抗原片上，每个稀释度的血清加两孔，量以不溢出为宜，置湿盒内，37℃感作30min，取出用 PBS冲洗三遍，加用PBS作（1：10）～（1：50)稀释的荧光素标记二抗（内含伊文斯兰1：1000)，置湿 盒内，37℃感作30min，取出用PBS冲洗三遍，空气干燥后，用pH9.0的碳酸缓冲甘油封片，荧光显微 镜下观察。 6.2 ELISA试验 6.2.1包被 按照提供的重组核蛋白抗原所附说明书要求，用包被液将抗原稀释，包被96孔板，每孔100μL，置 4℃冰箱过夜。 6.2.2血清稀释 将待检血清和阴、阳性血清用稀释液作1：400至1：6400的倍比稀释。 6.2.3加样 取出96孔板，用洗涤液洗涤三次，每孔加100μL稀释血清，每个稀释度的血清加两孔，37℃感作 2