SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 0184.3—2008 进出口食品中单核细胞增生 李斯特氏菌检测方法 第3部分：免疫磁珠法 Determination of Listeria monocytogenes in food for import and export- Part 3 : Immuno-magnetic beads assay 行业标准信息服务平台 2008-09-04发布 2009-03-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T0184.3—2008 前言 本部分的附录A、附录B均为规范性附录。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本部分主要起草人：吴斌、李振荣、胡传伟、王玉萍、蒋维旗。 本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 SN/T0184.3—2008 进出口食品中单核细胞增生 李斯特氏菌检测方法 第3部分：免疫磁珠法 1范围 方法。 本部分适用于进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过SN/T0184本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件， 其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议 的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。 GB19489实验室生物安全通用要求 3方法概述 将直径0.05um～4um具有磁性的微珠的表面化学修饰，并与李斯特氏菌特异性抗体结合，制成 免疫磁珠，它能与食品中李斯特氏菌抗原结合，从而检出食品中的李斯特氏菌。样品经24h～48h增 菌后，分别取1mL增菌液和20μuL免疫磁珠加人带盖塑料管中，在磁板背景下混合，如果有李斯特氏 菌抗原存在，免疫磁珠就会将其捕获，然后利用磁性将免疫磁珠聚集，经清洗后接种到显色培养基和任 选一种培养基（OXA或PALCAM琼脂），对于选择性分离平板上典型李斯特氏菌菌落进行确认，最终 通过系列试验确定是否存在单核细胞增生李斯特氏菌。 4设备和器具 4.1培养箱：37℃±1℃；41.5℃±1℃ 4.2水浴锅：45℃±1℃。 4.4刻度移液管：5mL、10mL。 4.5灭菌玻璃器具：量筒、三角烧瓶、培养血（直径90mm）、试管。 4.6灭菌管（Eppendorf管）：1.5mL。 4.7抗李斯特氏菌免疫磁珠：该磁珠可以通过商业途径获得。应准确地按照生产商的说明书进行 操作。 4.8旋涡混合器 4.9带有磁架的磁性分离器。 5培养基和试剂 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。 5.1胰酪大豆肉汤（TSB-YE)：见第A.1章。 SN/T 0184.3—2008 5.2月 胰酪大豆琼脂（TSA-YE）：见第A，2章。 5.3Fraser肉汤增菌液（FB，FB,）：见第A.3章。 5.4OXA琼脂：见第A.4章。 5.5PALCAM琼脂：见第A.5章。 5.6显色培养基。 注：本部分使用的培养基为CHROMagar公司产品，其他公司的等效显色培养基应验证后使用。 5.7磷酸盐缓冲溶液(PBS)：见第A.6章。 5.8参考菌株：单核细胞增生李斯特氏菌（CMCC54002）。 6检验步骤 6.1样品制备 在均质袋中加入25g样品，再加人225mLFB增菌肉汤（见5.3），30℃培养24h土1h 6.2增菌 取1mL6.1中制备好的样品，加到10mLFB，增菌液（见5.3）中，35℃培养24h士1h后，进行免 疫磁珠分离 6.3免疫磁珠分离（IMS) 6.3.1免疫捕获 混合6.2增菌培养液，沉淀所有的粗糙食物残渣，从增菌培养液中移取1mL上层液体（要尽可能 避免移取到食物颗粒和脂肪颗粒）加人Eppendorf管（见4.6)中，加20μL准备好的免疫磁珠（见4.7）。 在旋涡混合器（见4.8）上混合该悬液。 6.3.2分离 将Eppendorf管固定在磁架（见4.9）的管孔中，180°轻缓摆动磁架5次～6次，使免疫磁珠聚集到 磁极。小心地打开磁架上的Eppendorf管管盖，从磁极对面一侧慢慢吸出液体，注意不要接触管壁上的 磁珠，每一个样品换一次枪头；加1mL灭菌的PBS（见5.7），并重新盖好盖子，将磁极从支架上移走， 180°轻缓摆动磁架5次～6次，使管内各成分混合，然后重新将磁极放回到支架上。重复该清洗步骤几 次。将离心管从磁性分离器上移开，并加100μL灭菌的PBS（见5.7)到管中，重悬磁珠。如果实验室 没有磁性分离器，也可以用手摇代替。 6.4分离培养 6.4.1分离培养 PALCAM（见5.5）琼脂平板上，用无菌接种环划线，35℃士1℃培养24h～48h。 6.4.2筛选 李斯特氏菌在CHROMagar显色培养基上菌落为蓝色，且在其周围形成一个晕环。李斯特氏菌在 OXA琼脂平板上生长24h后菌落呈现黑色，直径为1mm，在其周围形成一个黑色环，培养48h，菌落 仍呈黑色，直径2mm～3mm，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。李斯特氏 菌在PALCAM琼脂平板上与在OXA琼脂平板上菌落相似。在CHROMagar显色培养基及OXA或 PALCAM琼脂平板上挑取5个或更多可疑菌落，接种于TSA-YE琼脂（见5.2）平板上，纯培养后进 鉴定。 6.5鉴定和确认 单核细胞增生李斯特氏菌的鉴定和确认按SN/T0184.1执行，单核细胞增生李斯特氏菌检验程序 图见附录B。 7质量控制 每次检验均应用单核细胞增生李斯特氏菌（见5.8）进行质量控制。 2