ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3475—2019 饲料中貂、狐貉源性成分的定性检测 实时荧光PCR法 Identification of martes, fox and Nyctereutes procyonoides- originated ingredients in feeds-Real time PCR method 行业标准信息服务平台 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3475—2019 前 国农业 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则章 共服务平台 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）归口。 本标准起草单位：山东省饲料质量检验所。 本标准主要起草人：冯鑫磊、李会荣、宫玲玲、李祥明、李俊玲、杨智国、朱良智。 行业标准信息服务平台 I NY/T3475—2019 饲料中貂、狐、貉源性成分的定性检测 实时荧光PCR法 1范围 本标准规定了饲料中貂、狐和貉源性成分的实时荧光PCR法定性检测。 性成分的定性检测。 本标准的检出限为0.5%。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡尼 期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本 （包括所有的修改单）适用于本 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699. 饲料采样 动物饲料试样的制备 GB/T 20195 GB/T 27403 实验室质量持 控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于 3. 1 Ct值循环值 cyclk threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 4缩略语 下列缩略语适用了 DNA：脱氧核糖核 (deosyribonileicacid) RNA：核糖核酸(ribo Icacid dNTP：脱氧核苷酸三磷酸(deoxyttbon） esidetriphosphate) dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosi phate dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosh Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethyl ammoniumbromide） EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid) Taq：水生栖热菌（thermusaquaticu） FAM：羧基荧光素（carboxyfluorescein） TAMRA：羧基四甲基罗丹明（carboxy-tetramethyl-rhodamine) ROX：6-羧基-X-罗丹明（6-carboxyl-X-rhodamine） BHQ2:black hole quencher 2 JOE：2，7-二甲基-45-二氯-6-羧基荧光素（6-carboxy-4"，5-dichloro-2"，7"-dimethoxyfluorescein， succinimidyl ester) 1 NY/T 3475—2019 5原理 用裂解液裂解试样中的细胞，用三氯甲烷去除蛋白等杂质，再用异丙醇沉淀得到DNA，进一步用乙醇 溶液纯化DNA。用特异性检测引物和探针对DNA进行实时荧光PCR扩增，根据扩增曲线与Ct值对试 样中貂、狐、貉源性成分进行定性检测。 6试剂或材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。所有试剂溶液均用无DNA酶和RNA酶污染 的容器分装。 6.1水：符合GB/T6682规定的一级水。 6.2异丙醇。 6.3蛋白酶K(20mg/mL)。 6.4 TagDNA聚合酶(5U/μL)。 6. 5 dNTP溶液(含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP各 2. 5 mmol/L)。 6.6 MgCl2溶液(25 mmol/L)。 6.710X PCR缓冲溶液。 6.8Tris-HCI溶液（1mol/L)：称取121.1gTris，加800mL水溶解，冷却至室温后，用浓盐酸调节溶液 的pH至8.0，加水定容至1L，121℃高压灭菌20min备用。 6.9EDTA溶液（500mmol/L)：称取186.1gEDTA-Naz·2HzO，加800mL水溶解，用10mol/L氢氧 化钠溶液调节溶液的pH至8.0，加水定容至1L，121℃高压灭菌20min备用。 6.10CTAB裂解溶液：称取10.02gCTAB、40.91gNaCl,加800mL水溶解，加入50mLTris-HCl溶 6.11TE缓冲溶液：在800mL水中，依次加人10mLTris-HCI溶液（6.8)和2mLEDTA溶液（6.9)， 用水定容至1L，121℃高压灭菌20min备用。 6.12检测用引物和探针序列见附录A。 6.13乙醇溶液：无水乙醇十水=7十3。 6.14三氯甲烷和异戊醇混合溶液：三氯甲烷十异戊醇=24+1。 6.15基因组 DNA提取试剂盒。 标准信 7仪器设备 7.1实时荧光PCR仪。 服务平台 7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计：波长（260±1）nm，（280±1）nm。 7.3分析天平：感量0.1mg。 7.4台式离心机：转速不低于12000r/min。 7.5恒温水浴锅：65℃，精度为士1℃。 7.6高压灭菌锅。 7.7涡旋振荡器。 8样品 8.1试样的制备 按GB/T14699.1的规定，抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。按GB/T20195的规定制 备试样，过0.15mm孔径筛后充分混匀，装入磨口瓶中备用。 2