ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3464—2019 牛泰勒虫病诊断技术 Diagnostic techniques for bovine theileriosis 行业标准信息服务平台 2019-11-01实施 2019-08-01发布 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3464—2019 前 VA 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起章。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。 本标准主要起草人：罗建勋、刘军龙、关贵全、股宏、刘爱红、李有全。 行业标准信息服务平台 NY/T3464—2019 牛泰勒虫病诊断技术 1 范围 本标准规定了环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫的检测技术及其所引起的牛勒虫病的诊断技术要求。 本标准适用于牛泰勒虫病病原检测及急性临床病例的诊断。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersolution） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） 4材料与试剂 4.1试剂 4.1.1除特别规定外，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682的要求。 4.1.2姬姆萨(Giemsa)染色液原液（见附录A中的A.1)。 4.1.3姬姆萨染色液工作液（见A.2）。 4.1.4甲醇。 4.1.5香柏油。 4.1.62×PremixTag酶混合液（商用）：包含DNA聚合酶、缓冲液和2.5mmol/L的dNTP混合物。 准信息服 4. 1.7 无RNase水。 4. 1.8 全血基因组提取试剂盒。 4.1.9琼脂糖（电泳级)。 4. 1.10 1XTAE(见A.3)。 4.1.1110mg/mL溴化乙锭（EB)或同类核酸染料（见A.4）。 4.1.12环形泰勒虫阳性对照（用环形泰勒虫感染牛，染虫率达到5%以上时，提取血液基因组DNA，稀 释至 1 ng/μL)。 4.1.13瑟氏泰勒虫阳性对照（用瑟氏泰勒虫感染牛，染虫率达到5%以上时，提取血液基因组DNA，稀 释至 1 ng/μL)。 4.1.14泰勒虫阴性对照（筛选泰勒虫阴性牛，提取血液基因组DNA，稀释至1ng/μL)。 4.2耗材 4.2.1载玻片。 4.2.2抗凝真空采血管。 4.2.3剪毛剪。 4.2.41.5mL无菌离心管。 NY/T3464—2019 4.2.5200μLPCR管。 4.3仪器 4.3.1光学显微镜（含100X物镜）。 4.3.2PCR扩增仪。 4.3.3核酸电泳系统。 4.3.4凝胶成像仪。 4.3.5单道微量移液器（1L~10L；10μL~100μL；100μL~1000μL）。 4.3.6 高速离心机。 生物安全要求 定执行。 临床诊断 6. 1 典型临床症 6. 1. 1 稽留热 本温 6. 1. 2 眼结膜 中联 长可 钻膜黄冰 6.1.3浅表法 吉肿胀， 地坚硬触诊敏器 6. 1. 4 贫血 淡黄战 深黄佰无面 6.2典型病理变 6.2.1血液 膜黄染见出 6.2.2体表淋 参见附录 6.2.3皱胃 或溃疡 见B2)。 CENT 6.3流行特 CU 6.3.1 多发 6.3.2患病动物体 6.3.3 1岁~3 纯种和改良生带出 明显 临 床症状。 6.4结果判定 牛只出现6.1和 的变化 动虫光 7 血涂片显微镜检查 7.1血涂片制备 用剪毛剪剪除牛耳尖牛毛，针头刺破耳尖：挤 商耳尖静脉血于玻片土，用推片推成有末梢的薄血 涂片，并迅速晾干。 7.2血涂片固定 加3滴甲醇于血涂片上进行固定，晾干后重复一次。 7.3血涂片染色 将姬姆萨染液工作液滴加到甲醇固定好的血涂片上，室温染色30min后，用自来水充分冲洗掉残留 的染色颗粒，吹风机吹干或自然晾干后待检。 7.4显微镜检查 血涂片上滴加一滴香柏油，在1000倍（10×100）光学显微镜下观察100个视野。 7.5结果判定 7.5.1阳性：红细胞内观察到泰勒虫典型虫体时，可确诊（参见附录D)。 2