ICS 65.020.30 B 43 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3446—2019 PCR法 奶牛短脊椎畸形综合征检测 Detection of brachyspina syndrome in dairy cattlePCRmethod 行业标准信息服务平台 2019-11-01实施 2019-08-01发布 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3446—2019 前 N 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。成 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TCV274)归口。 本标准起草单位：农业农村部牛冷冻精液质量监督检验测试中心（北京）、北京奶牛中心、中国农业大 学、农业农村部种畜品质监督检验测试中心、农业农村部牛冷冻精液质量监督检验测试中心（南京）、全国 畜牧总站。 本标准起草人：张晓霞、李艳华、麻柱、刘林、张胜利、房灵昭、韩广文、薛建华、钟代彬、刘丑生、陆汉希、 李姣。 行业标准信息服务平台 I NY/T 3446—2019 奶牛短脊椎畸形综合征检测 PCR法 1 范围 本标准规定了奶牛短脊椎畸形综合征的PCR检测方法。 本标准适用于奶牛短脊椎畸形综合征基因型的分子检测与诊断。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 3术语和定义 RE 3. 1 短脊椎综合征 brachyspina syndrome,BS 缩短，胎儿在妊娠后期流产 死亡等临床症状。该遗传缺陷是由21号染色体 29 Bp(BTA21:21184870- complementation-grouf1 基因2527外显子缺失引起的，缺失长度3 RCH R 21188198)。 U 4原理 基因缺失的2527外显子，在缺失片段两侧 ，进行长片段PCR 针对FANCI 扩增，根据PCR 物大小判定个体基因型 5PCR引物 引物 BSR: 5'-ATAAATA- AATAAAGCAGGATCCTGAAA 预期扩增片段长度：3738bp/409bp 图 A.1。 6试剂和材料 除非另有说明，在试验中仪使用确认为分析纯的试剂或蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 务平台 6.1长片段TaqDNA聚合酶 6.210×PCR缓冲液（含Mg2+） 6.3dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP4种溶液的等比例混合液） 6.4DNA分子量标记 6.5核酸染料 6.6琼脂糖 6.775%乙醇 6.850×TAE缓冲液 取Tris碱242g，冰乙酸57.1mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)100mL,加水定容至1000mL,室温 保存。 1 NY/T 3446—2019 7仪器设备 7.1PCR扩增仪 7.2凝胶成像分析系统 7.3电泳仪 7.4水平电泳槽 7.5可调移液器 7.6离心机 7.7干式加热器(或水浴锅) 7.8电子天平 8样品 8.1样品准备 收集牛血液（新鲜或抗凝血）、组织（耳组织、肌肉、尾组织、皮肤等）、带毛囊的牛毛、精液等试验材料。 血液、精液、组织样品一20℃及以下低温保存备用；带毛囊的毛发浸入75%乙醇中一20℃及以下低温保存 备用。 8.2DNA提取 按GB/T27642规定的方法执行。 9试验步骤 9.1PCR扩增 9.1.1PCR反应体系 10XPCR缓冲液(含Mg2+)2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)4.0μL,上、下游引物(10μmol/L)各0.5μL, DNA模板50ng100ng，长片段TaqDNA聚合酶1.5U，加水至25μL。 9.1.2PCR反应程序 94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸2.5min，35个循环；72℃聚合延伸10min， 4℃保存。 9.2电泳检测 9.2.12.0%琼脂糖凝胶制备 称取2g琼脂糖，加100mL1XTAE煮沸，等温度降至50℃～60℃时，加人核酸染料或其他替代物。 9.2.2上样电泳 取5μLPCR扩增产物，上样于2.0%琼脂糖凝胶中进行电泳（3V/cm~5V/cm，电泳1.0h~1.5h）， 服务平台 在凝胶成像系统中观察电泳条带。 10试验数据处理 10.1正常个体 仅扩增出一条长3738bp的PCR产物，基因型命名为AA型。 10.2BS隐性携带者 同时扩增出长3738bp和409bp的PCR产物，基因型命名为AB型。 10. 3 BS 患病牛 仅扩增出一条长409bp的PCR产物，基因型命名为BB型。 PCR检测结果示意图参见图A.2。 2