ICS 07.080 B 47 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3421—2019 家蚕核型多角体病毒检测 荧光定量PCR法 Detection of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus-Real time PCR method 行业标准信息服务平台 2019-09-01实施 2019-01-17发布 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3421—2019 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部种植业管理司提出。 本标准由全国桑蚕业标准化技术委员会（SAC/TC437）归口。 本标准起草单位：江苏科技大学、西南大学、中国农业科学院蚕业研究所、苏州大学、华南农业大学、 农业农村部蚕桑产业产品质量监督检验测试中心（镇江）。 本标准主要起草人：吴萍、潘敏慧、郭锡杰、贡成良、孙京臣、董战旗、陈涛、侯启瑞、商琪。 行业标准信息服务平台 NY/T 3421—2019 家蚕核型多角体病毒检测 荧光定量PCR法 1范围 本标准规定了家蚕核型多角体病毒（Bombyrmorinucleopolyhedrovirus，BmNPV）的实时荧光定 量PCR检测方法。 本标准适用于家蚕核型多角体病毒的检测。 2规范性引用文件 件，仅注日期的版本适用于本文 GB/T 6682 IN 3术语和定义 适用子本 下列术语和定义造 文件 S 3. 1 gp64基因 gp64 gehe 杆状病毒囊膜蛋之基肉 编码出牙型 R 4缩略语 U 下列缩略语通 适用手本文件 BmNPV: 核型多角体病毒 Ct值：每 立管内 光达 种脱氧核糖核 dNTPs：脱氧 北白磷酸混 mixt 苷酸dATP、dTTP PBS:磷酸缓 PCR：聚合酶链 SDS：十二烷基磺酸钠 (sodiun sulfate 5原理 利用荧光信号伴随目的PCR 物的增加而增强的原理，收集PCR 增过程的荧光信号值，根据Ct 值判断供试样品是否含有家蚕核型多角体病毒。根据BmNPV必基因的保守序列设计特异性PCR 引物进行PCR扩增反应。 6试剂与材料 6.120%SDS：称取20gSDS溶解于200mL烧杯中，加人80mL水，60℃水浴加热并用玻璃棒充分搅 拌至溶解，定容至100mL。高压灭菌后，置于4℃冰箱保存备用。 6.26mol/LNaCl:称取351gNaCI放入容量为1L的烧杯中，加入800mL水，玻璃棒充分搅拌至溶 解，定容至1L。高压灭菌后，置于4℃冰箱保存备用。 6.3蛋白酶K20mg/mL：称取200mg蛋白酶K加人到9.5mL水中，轻轻摇动，至蛋白酶K完全溶 解，加水定容至10mL，分装成小份置于一20℃冰箱保存备用。 NY/T3421—2019 6.470%乙醇。 6.5异丙醇。 6. 6 PBS(组分: NaCI 136. 89 mmol/ L; KCI 2. 67 mmol/ L; Na2 HPO, 8. 1 mmol/ L; KHzPO, 1. 76 mmol/L;pH=7.2~7. 4)。 6.7苯基硫脲。 6.8 RNase酶。 6.9荧光定量PCR试剂盒。 6.10灭菌的枪头和离心管。 注：除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682一级水的规定。 7主要仪器设备 7.1实时荧光定量PCR仪。 7.2紫外分光光度计。 7.3高速冷冻离心机。 7.4-20℃冰箱和一80℃冰箱。 7.5组织研磨器或研钵。 7.6微量加样器。 8样品 8.1样品采集 8.1.1血液：用灭菌针刺破家蚕幼虫腹足或尾足，在冰上将血液采集于加了少量苯基硫脲的试管中， 12000g，4℃离心30min，吸取上清液，一20℃冰箱保存备用。 8.1.2组织：采集家蚕组织（50mg~100mg）后迅速放人液氮中，再转移至一80℃冰箱保存备用。 8.2样品DNA提取 8.2.1将组织样品放人预冷的研钵中加人液氮，用研杆将待检样品磨成粉末状，研磨过程中保持液氮 不挥发干净。亦可用组织匀浆器按操作说明书处理样品。 8.2.2在血液或按步骤8.2.1制备的样品中加入400μL灭菌的PBS、4μL10mg/mLRNase酶、 40μL20%SDS和8μL20mg/mL蛋白酶K，混合均匀，并将样品置于55℃~60℃水浴10min~15 min，或者放置室温直至溶液澄清。V 8.2.3在8.2.2溶液中加人300μL6mol/LNaCl溶液，反复颠倒，轻柔混匀。12000g4℃离心10 min，收集上清液。 8.2.4将上清液转移至新的已灭菌的离心管中，加入等体积的异丙醇或者2倍体积的无水乙醇，混合 均匀后放置一20℃冰箱30min，12000g，4℃离心10min，弃上清液，保留DNA沉淀。 8.2.5加500μL70%预冷乙醇洗涤沉淀，12000g，4℃离心5min，去乙醇。 8.2.6将DNA沉淀置于室温下自然风干5min~10min，用30μL~40μL的无菌超纯水常温溶解 DNA。 8.2.7利用紫外分光光度计测定DNA溶液的光密度值。当A260/A280值为1.75～1.85时，提取的 DNA质量符合PCR的检测要求。调整DNA浓度至50ng/μL并置于一20℃冰箱保存备用。 注：以上提供的DNA提取方法并非唯一方法。其他提取方法或市售商品化DNA提取试剂盒也可使用。 8.3实时荧光定量PCR检测 8.3.1引物序列 2