SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 36312013 出口贝类中肠道病毒EV71的检验方法 实时荧光RT-PCR方法 Detection of Enterovirus71 in shellfish for export- Real-time fluorescence RT-PCR 行业标准信息服务平台 2013-08-30发布 2014-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3631—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、深圳太太基因工程有限公司。 本标准主要起草人：曾宪东、陈建军、徐家文、肖性龙、郭明星、赵晖、冯汉利、王振华。 行业标准信息服务平台 SN/T3631—2013 出口贝类中肠道病毒EV71的检验方法 实时荧光RT-PCR方法 1范围 本标准规定了贝类中EV71病毒的荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于贝类中EV71病毒的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 肠道病毒EV71Enterovirus71 肠道病毒EV71，即肠道病毒71型（简称EV71），属于微小RNA病毒科、肠道病毒属，EV71及Cox A16型是手足口病最为常见的致病病毒。肠道病毒属包括脊髓灰质炎病毒（Poliovirus），柯萨奇病毒 （Coxasckievirus）A组16、4、5、7、9、10型和B组2、5、13型，埃可病毒（ECHOviruses）以及肠道病毒 68、69、70、71、72等血清型。 3.2 荧光RT-PCRreai-time fluorescence RT-PCR 实时荧光定量RT-PCR方法是在常规RT-PCR的基础上，加入了一条特异性的荧光探针。该探针 为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个灭荧光基团。探针完整时，报告基团发出的信 号被萍灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬火 实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。 3.3 Ct 值cycle threshold 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。 4方法概要 在甘氨酸缓冲液中通过高速匀浆的物理方式对食品样品进行均质，经过温育促进病毒颗粒的释放， 再利用PEG8ooo沉降病毒粒子。然后采用Trizol-reagent或其他等效裂解液提取沉淀物的总RNA，并 进一步使用包被了Oligo（dT）25的磁珠与EV71病毒RNA3端的Poly（A）尾巴特异性结合，纯化病毒 1