SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3579—2013 大豆疫霉病菌活性检测方法 Viability detection of Phytophthora sojae Kaufmann & Gerdemann 行业标准信息服务平台 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3579—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、广东省微 生物研究所、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：章桂明、程颖慧、王颖、陈枝楠、仲建忠、李秋枫、向才玉、代京莎、汪莹、陈洪俊。 行业标准信息服务平台 SN/T3579—2013 大豆疫霉病菌活性检测方法 1范围 本标准规定了应用激光扫描共聚焦显微镜对大豆疫霉病菌（PhytophthorasojaeKaufmann& Gerdemann)的活性进行检测的方法。 本标准适用于大豆及土壤中携带的大豆疫霉病菌的活性检测。 2原理 应用荧光染料对大豆疫霉病菌的卵抱子进行染色处理，根据大豆疫霉病菌不具活性的卵抱子染色 后卵质体断裂，边集，呈致密浓染绿色和具有活性的卵抱子染色后卵质体均匀绿色的染色效果差异， 运用激光扫描共聚焦显微镜对病菌抱子进行检测，分析其活性情况。 3仪器用具和试剂 3.1仪器用具 激光扫描共聚焦显微镜、显微镜、高压灭菌锅、生物安全柜、生化培养箱、冰箱。 3.2试剂 吖定橙、磷酸缓冲液(PBS,0.1mol/uL,pH7.0)、水琼脂培养基。 4活性检验方法 4.1病原菌孢子获取 在显微镜下，将发现并鉴定为大豆疫霉病菌卵孢子挑到灭菌水中，配制成浓度大于1个孢子/μL的 孢子悬浮液，镜检，备用。 4.2孢子染色 使用质量浓度为100μg/mL（溶剂为PBS)的吖定橙染色剂与孢子悬浮液以1：20体积比均匀混 子浓度大于1个孢子/uL。避光放置备用。 4.3激光扫描共聚焦显微镜活性检测 4.3.1将完成染色样品制备玻片，封片，倒置于激光扫描共聚焦显微镜载物台上，低倍镜下找到孢子， 转到63倍油镜下观察，微调至视野内图像清晰。 4.3.2选择相应的激光管（氩离子激光器）激发荧光信号，设置荧光通道的激发波长（488nm），收集荧 光信号的发射波长（505nm），并设置一个明场通道作为对照 4.3.3选择低像素的平面扫描方式进行粗略扫描（xy：512×512），依据扫描成像效果中荧光信号强弱 1