SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3577—2013 转基因成分检测 棉花PCR-DHPLC检测方法 Detection of genetically modified components- Method for cotton using PCR-DHPLC 行业标准信息服务平台 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3577—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中国检验 检疫科学研究院、深圳博睿祥晖生物技术有限公司、国家纳米科学中心。 本标准主要起草人：章桂明、朱水芳、向才玉、程颖慧、凌杏园、汪朝晖、朱劲松、黄新、欧阳辉、王颖、 仲建忠。 行业标准信息服务平台 SN/T3577—2013 转基因成分检测 棉花PCR-DHPLC检测方法 1范围 本标准规定了进出境棉花中转基因成分和品系的PCR-DHPLC检测方法。 因成分和品系的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 SN/T1193基因检验实验室技术要求 3原理 变性高效液相色谱技术（denaturinghigh-performanceliquidchromatography，DHPLC）是一种筒 单、快速、非凝胶的核酸分析方法，在50℃条件下分析样品，碱基对的数量决定样品峰的洗脱顺序，当过 柱的乙睛浓度提高，核酸片段会根据相对分子质量从小到大的顺序被洗脱出来。本标准采用多重PCR 方法针对转基因棉花含有的转基因成分同时进行扩增，扩增产物用DHPLC进行分析。通过DHPLC 得到的洗脱峰与marker比较确定相对分子质量大小，判定是否带有外源基因成分及确定转基因棉花 信息服务 品系。 4设备、用具及试剂 4.1设备及用具 组织粉碎机、PCR仪、DHPLC仪、水浴锅、电子天平（精度：1/1OO0以上）、普通离心机、低温冷冻高 速离心机、冰箱、低温冰箱、制冰机、恒温干燥箱、pH计、移液器（0.1uL，0.5μL，2μL，10μL.20uL， 100μL,200μL，1000μL）、紫外可见分光光度计、纯水机、高压消毒锅、PCR管（0.2mL）、离心管（1.5mL， 2.0 mL)、Tip头(0.1μL~10 μL,5 μL~200μL,100 μL~500 μL)。 4.2试剂 CTAB提取液、Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、70%乙醇、RNA酶（10mg/mL）、多重PCR 反应液缓冲液（MultiplexPCRMix）、TaqDNA聚合酶，DHPLC缓冲液A：TEAA（O.1mol/L，pH7.O）、乙 睛（0.025%），DHPLC缓冲液B：TEAA（0.1mol/L，pH7.0）、乙睛（25%），DHPLC缓冲液D：乙睛 （75%，pH7.0）分子量标记（marker）。 1