SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3580—2013 四种大豆危险性真菌多重实时荧光 PCR检测方法 Detection and identification of four kinds of soybean fungal diseases with multiplex real-time PCR 行业标准信息服务平台 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3580—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、辽宁省农 业科学研究院。 本标准主要起草人：章桂明、王颖、程颖慧、郑耘、陈枝楠、缪建锟。 行业标准信息服务平台 SN/T3580—2013 四种大豆危险性真菌多重实时荧光 PCR检测方法 1范围 本标准规定了大豆上的危险性真菌一一大豆疫霉病菌（Phytophthorasojae）、大豆北方茎溃疡病菌 （Diaporthephaseolorumvar.caulivora）、大豆南方茎溃疡病菌（Diaporthephaseolorumvar. meridionalis）和大豆拟茎点种腐病菌（Phomopsislongicolla）的多重实时荧光PCR检测鉴定方法。 本标准适用于大豆上的大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌和大豆拟茎点种腐病菌以及大 豆夹杂的土壤等传带大豆疫霉病菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1131大豆疫霉病菌检疫鉴定方法 SN/T1193基因检验实验室技术要求 SN/T1899大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法 3原理 根据大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌大豆南方茎溃疡病菌和大豆拟茎点种腐病菌的分子生物 学特性，设计其各自的特异性引物和探针。探针的5标记为不同的荧光报告基团，3端标记为荧光萍 灭基团，通过寡核酸连接进行荧光谐振能量传递。在扩增反应中，由于扩增酶的5端外切酶作用将与 信号标记类型其需要的激发光条件不同，能够被收集到的荧光信号也有所不同，从而实现多重检测。 4仪器、用具及试剂 4.1仪器及用具 烘箱、高压灭菌锅、天平（感量1/100，1/10000）、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯水机、旋涡振荡机、 台式离心机、高速冷冻离心机、真空抽干机、冰箱、超净工作台、实时荧光PCR仪、微量移液器（0.5uL， 10 μL,5 μL~200 μL,100 μL~1000 μL)。 4.2试剂 PDA培养基、V8培养基、水琼脂培养基、实时荧光PCR反应缓冲液、CTAB提取缓冲液、Tris饱和 酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、RNA酶、液氮。 1