SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 20222007 牛温氏附红细胞体聚合酶链式反应 操作规程 Protocol of polymerase chain reaction (PCR) for Eperythrozoonwenyoni 行业标准信息服务平台 2008-07-01实施 2007-12-24发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T20222007 前 言 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、华中农业大学。 本标准主要起草人：李树清、胡永强、赵俊龙、王巧全、陈志飞、杜凯、王贵强、刘焕章。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 SN/T2022—2007 牛温氏附红细胞体聚合酶链式反应 操作规程 1范围 本标准规定了温氏附红细胞体聚合酶链式反应方法。 本标准适用于温氏附红细胞体的鉴定和检测 2概述 温氏附红细胞体（Eperythrozoonwenyoni，E.wenyoni）是附着于牛的红细胞或游离于胞浆的一种 立克次氏体，可通过吸血昆虫、螨虫、母体胎盘、血液等传播。牛感染E.enyoni一般不表现临床症状， 严重感染引起发热、消瘦和黄疽。本标准根据E.enyoni16SrRNA的保守序列，设计了一对特异引物 mwF/mwR3，通过PCR反应可扩增出738bp的片段，用于温氏附红细胞体的鉴定和检测。 3设备和材料 3.1仪器设备 3.1.1PCR扩增仪。 3.1.2电泳仪。 3. 1. 3 凝胶成像系统。 3.1.4 微波炉。 3. 1.5 可调移液器（2μL，10μL，100μL，200μL，1000μL）。 3. 1. 6 离心机。 3. 1.7 天平（0.0001g）。 行业标准信息服务平台 3. 1.8 水浴锅。 3.2耗材 3.2.1PCR反应管。 3.2.2 1.5mL离心管。 3.2.3移液器滴头。 3.3试剂 3.3.1 三蒸水0.103MPa灭菌15min。 3.3.2 琼脂糖。 3.3.3溴化乙锭。 3.3.4 Taq酶(5 U/μL)。 3.3.5 10XPCR反应缓冲液。 3.3.6氯化镁（MgCl)25mmol/L。 3. 3.7 1 mmol/L dNTP。 3. 3.8 苯酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1）。 3.3.9分子量指示物：100bp~2000bpDNAMarker。 3. 3. 10 050mg/mL溶菌酶、10%SDS、10mg/mL蛋白酶K、5mol/L氯化钠（NaCI）、5%十六烷基三甲 基溴化铵（CTAB）、2mol/L乙酸钠（NaAc）、70%乙醇、10mg/mL溴化乙锭（EB）、Tris-乙酸电泳缓冲