鹿流行性出血病琼脂免疫扩散试验 操作规程 Protocol of agar gel immunodiffusion test for epizootic haemorrhagic disease of deer SN / T 1167—2002 前言 本标准是在参考国际兽疫局（OIE）及美国国家兽医实验室的操作规程和总结我国在这一领域 多年实践经验的基础上制定的。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：杨晶焰、应雪松、杨建明、徐自忠。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 1 范围 本标准适用于动物鹿流行性出血病琼扩抗体的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后 所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议 的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标 准。 GB/T6682一1992分析实验室用水规格和试验方法（eqVISO3696：1987） 标准信息服务平台 3缩略语 下列缩略语适用于本标准。 3. 1 AGID Test 琼脂免疫扩散试验。 3. 2 EHD 鹿流行性出血病。 4原理 抗原及其特异性抗体在凝胶中从高浓度区域向低浓度区域扩散时所受阻力很小，基本上呈自 由扩散形式。由于不同抗原分子的分子量、结构、形状和电荷量不同，因此其扩散系数不同，在 凝胶中的扩散速度也就不同。当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇，形成抗原抗体复合物， 若两者在相遇处比例适当，则形成最大的复合物。由于复合物的分子量增大，颗粒增大，因而不 再继续扩散而产生沉淀，呈现出线状或带状，其形成的线状或带状的“特异性屏障”称为免疫沉 淀线或免疫沉淀带。 5试剂和材料 5.1抗原：用从美国国家兽医实验室引进的EHDV-2型国际标准毒株，参考该实验室的抗原制备方 法制备，为群特异性抗原，适用于各型EHD的检疫，由指定单位提供。 5.2标准阳性血清：琼脂扩散效价在1：8以上，由指定单位提供。 5.3平皿。 5.4微量移液器。 5.5微量滴头。 5.6三角烧瓶。 5.7琼脂糖：分析纯。 5.8氯化钠(NaC1)：分析纯。 5.9叠氮钠：分析纯。 5.10水：符合GB/T6682一1992分析实验室二级水规格。 6操作步骤 6.1琼脂凝胶平板的制备：称取琼脂糖0.9g，氯化钠0.85g，加入100mL水，经68.94kPa、10 min高 压或电磁振荡煮沸溶解后，冷却至45℃，加入0.01g／100mL叠氮钠。每个平血加融化琼脂，使 琼脂板 厚度为2.5mm～2.8mm，待凝固后置4℃冰箱片刻。 6.2打孔：中间1孔，周围6孔为一组，每个平皿打四组。孔径4mm，孔间距2.4mm。 6.3加样：中心孔加抗原，1、3、5孔加标准阳性血清；2、4、6孔加被检血清。加样量以孔平为 准。加样 后置湿盒内于室温（22℃25℃）反应。 7判定 7.124h初判，72h终判。当阳性对照、弱阳性对照成立时，进行判定。 7.2阳性：被检血清孔与抗原孔之间出现致密的沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线末端呈平滑 相连者。 7.3弱阳性：标准阳性血清孔和抗原孔之间的沉淀线向被检血清孔内侧弯曲，而被检血清孔与抗 原之间未形成完整的沉淀线。 7.5阴性：抗原孔与被检血清孔之间不出现沉淀线和标准阳性血清与抗原孔间的沉淀线向毗邻的 被检血清孔直伸或向其外侧偏弯者。 7.6非特异性沉淀线：当抗原和被检血清孔之间出现的沉淀线与标准阳性血清的沉淀线交叉，为 非特异性反应，应判为阴性。 7.7第一次检查为阳性或弱阳性或可疑或非特异性沉淀线的样品，须重复试验。如重复试验结果 仍为阳性、弱阳性、可疑，均终判为阳性；结果仍为非特异性反应，终判为阴性。 行业标准信息服务平台