传染性胰脏坏死病毒（IPNV) 酶链免疫吸附试验(ELISA)诊断方法 Test method of enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) for infectious pancreatic necrosis virus(IPNV) SN/T 1162—2002 前言 本标准是在参考国际上通用的检测规程和总结我国在这一领域的实践经验的基础上制定的 作为对1996年发布的GB/T15805.1一1995（（淡水鱼类检疫方法第一部分》的一个补充。 鉴于目前ELISA快速检测技术已经成熟，具有灵敏、准确、快速的优点，制定此标准有极强 的实用性，对已有的国家标准能起到一个补充作用。 本标准的附录A是资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：江育林、刘、高隆英、史秀杰。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 1 范围 本标准规定了用酶联免疫吸附试验检测IPN病毒的方法。 本标准适用于IPN病毒的分离及病毒抗原的鉴定，及本病的流行病学调查、诊断、检疫和监 测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后 所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议 的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标 准。 GB/T6682一1992分析实验室用水规格和试验方法（eqV1S03696：1987） GB18088一2000出入境动物检疫采样 3试剂和材料 3.1水 应符合GB/T6682一1992中二级水的规格。 3.2 IPN一sp病毒 3.3阴性对照 正常细胞组织悬液（自备）。 3.4IPN-Sp病毒标准抗血清 3.5酶标羊抗兔IgG 4器材和设备 4.196孔细胞培养板。 4.2酶标板。 4.3酶标测定仪。 4.4微量移液器等。 4.5倒置显微镜。 4.6恒温培养箱。 4.7普通冰箱和低温冰箱。 4.8组织研磨器。 4.9离心机和离心管。 5IPN病毒的分离 5.1采样 对有临床症状的鱼，体长小于等于4cm的鱼苗取整条，体长4cm～6cm的鱼苗取内脏（包括 肾）；体长大于6cm的鱼则取肝、肾、脾。对无症状的鱼取肝、肾、脾；成熟雌鱼还需取卵巢 液；按GB18088-2000采样。 5.2样品处理 应在10C以下进行。先用组织研磨器将样品匀浆。再用培养液（见附录A.1)按1：10的最终稀 释度悬浮。在匀浆前未用抗菌素处理过的样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有抗菌素的培养液 中，于151℃下孵育2h～4h或4℃下孵育6h～24h。7000r／min离心15min，收集上清液， 液。 5.3病毒分离 对上述1：10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将这1：10、1：100和1：1000三种 稀释度的上清液，以适当体积分别接种到生长约24h的RTG一2，CHSE或者PG新鲜细胞单层中，每 2cm。的细胞单层最多接种100uL稀释液。15℃～20℃吸附1h后，加入细胞培养液。置于18℃ 土2℃培养。 阳性对照组和待测样品都接种细胞后，7d内每天用40倍～100倍倒置显微镜检查。如果接种 了被检物匀浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变（CPE)，应立即进行鉴定。如果除阳性对照 细胞外，没有CPE变出现，则在培养7d后还要用敏感细胞进行再传代培养。传代时，冻融并收集 接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物。7000r/min，4℃离心15min，收集上清液。 接种到新鲜细胞单层，培养7d。每天用40倍到100倍倒置显微镜检查。 如果在阳性对照组也未出现CPE，则必须采用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行另一系 列的病毒学检查。 6IPN病毒的鉴定 6.1包被羊抗IPN病毒抗体 将羊抗IPN病毒的IgG用包被稀释液（见附录A.3）稀释成工作浓度后包被酶标板，每孔0.1 mL。4C孵育12h～24h或者37℃反应1.5h～2h。倒出孔内液体。 6.2洗涤 将PBST（见附录A.4）加入小孔，2min后倒出，拍干。如此重复3次。 6.3加入待测样品 每个样品2孔，每孔0.1mL。另将已知标准IPN病毒（阳性对照）、正常组织样品（阴性对照） 和细胞培养液（空白对照）也各加2孔。37℃反应1.5h～2h。倒出孔内液体。用PBST洗3次，方法 同6.2。6.4加入免抗IPN血清 每孔加0.1mL稀释到工作浓度的兔抗IPN病毒血清（用细胞培养液稀释）。37℃反应1.5h～2 h。倒出孔内液体。用PBST洗2次，方法同6.2。 6.5消除非特异性过氧化物酶 每孔加0.1mL0.1%的双蒸水（用H202稀释）。37℃反应15min以除掉非特异性的过氧化物 酶。倒出孔内液体。用PBST洗2次，方法同6.2。 6.6加入酶标羊抗兔IgG结合物（酶标二抗） 每孔加入o.1mL稀释到工作浓度的酶标羊抗兔IgG（用细胞培养液稀释）。37℃反应1.5h～2 h。倒出孔内液体。用PBST洗3次，方法同6.2。 6.7加底物OPD溶液（见附录A.5） 每孔加入0.1mL毫升OPD溶液。室温下避光反应显色（约10min）。 6.8加终止液 当阳性对照出现明显棕黄色，阴性对照无色时，立即每孔加入0.2mL浓度为2mol/L硫酸终 止反应。 结果判定 样品经过接种细胞和盲传后均没有CPE出现，则结果判为阴性。有CPE出现，则要用ELISA方 法进行鉴定是否由IPN病毒引起。