植物检疫玉米霜霉病菌检疫鉴定方法 Plant quarantine-Methods for quarantine and identification of Peronosclerospora (lto) C.G. Shaw SN/T 1155—2002 前言 本标准的附录C为规范性附录，附录A、附录B、附录D为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：李德福、郭琼霞、陈艳、张广志、张晓燕。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 1 范围 本标准规定了植物检疫中玉米霜霉病菌检疫和鉴定方法。 本标准适用于玉米、甘蔗、高梁及其他寄主中玉米霜霉病菌的检疫和鉴定。 2原理 玉米霜霉病主要由高梁霜霉病菌（Peronosclerosporasorghi）、甘蔗霜霉病菌 (P.sacchari）、菲律宾霜霉病菌（P.philippinensis)和爪哇霜霉病菌（P.maydis)引起，该类病菌 （以下简称玉米霜霉病菌Peronosclerosporaspp.）属鞭毛菌亚门（Mastigomycotina）、卵菌纲 (Oomycetes）、霜霉目（Peronosporales）、霜霉科（Peronosporaceae）、霜指霉属 (Peronosclerospora）。玉米霜霉病菌除危害玉米外，还侵染其他植物（参见附录A）。一般情况下 玉米霜霉病菌引起系统性侵染，有时也引起局部侵染，受侵染的玉米叶片出现边界明显的失绿， 后期形成褐色坏死条斑。在温度17℃～29℃、环境湿润条件下，叶背面病斑长出一层白色霉状 物，即玉米霜霉病菌分生孢子和孢子梗。该病菌分生孢子及孢子梗形态、分生孢子萌发情况、卵 孢子形成情况、PCR特异性反应等特征是玉米霜霉病菌鉴定特征。 准信息服务平台 3仪器和用具 3.1显微镜、体视显微镜。 3.2PCR仪、电泳仪。 3.3冷冻高速离心机、台式微量离心机。 3.4普通冰箱、低温冰箱、恒温恒湿培养箱。 3.5普通天平（感量为1/100）。 3.6超净工作台。 3.7可调微量加样器。 3.8 Eppendorf管(1.5 mL、0.5 mL)、Oak Ridge离心管(30 mL)。 3.9镊子、扁头牙签。 3.10载玻片、盖玻片、培养nn（直径为15cm~20cm）。 3.11铝铂纸或Parafilm膜。 4试剂和材料 4.1三(羟甲基)氨基甲烷(C,HiNO3) 4.2乙二胺四乙酸（C1oH12N208) 4.3十二烷基硫酸钠［(CH2)120S0gNa] 4.42一巯基乙醇(C,Hg0S 4.5异丙醇（C3Hg0) 4.6异戊醇(C,H100) 4.7 乙醇(CH,CH2 OH) 4.8溴酚蓝(CigH100,Br4S) 4.9苯胺蓝(C37H29N3·HCI) 4. 10 甘油(CH,OH · CHOH · CH,OH) 业标准信息服务平台 4.11二甲苯苯胺（CgHiN) 4.12苯(C.Hb) 4.13乙酸钠(CH,COONa) 4.14 醋酸钾(CH,COOK) 4.15三氯甲烷（CHC13) 4.16氯化钠(NaC1) 4.17氯化钾(KC1) 4.18氯化镁（MgCI,) 4.19氢氧化钠(NaOH) 4.204种脱氧核苷三磷酸（dNTP） 4.21TaqDNA聚合酶 4.22核糖核酸酶RNaseA 4.23溴化乙锭（CH2Br·CH,Br) 4.24矿物油 4.25吐温-20 4.26琼脂粉 4.27液态氮（N) 4.28 1 kb DNA(浓度为25 ng / μL) 5现场检疫与取样 5.1现场检疫 现场核对货物有关单证，核实产地、包装、唛头、品名及数量。仔细检查进境玉米霜霉病菌 寄主种子或原粮中是否夹带高梁、甘蔗叶片病残体，是否夹带带颖壳的高梁种子；检查进境甘蔗 插条和其他玉米霜霉病菌寄主种苗叶片是否有可疑病斑，将检获物一并带回实验室内检验。 5.2原粮和种子取样 5.2.1原始样品和复合样品制备 船运散装进境的玉米霜霉病菌寄主种子或原粮，分船舱、分层次、分品种按棋盘式30个～50 个点扦取原始样品，每份原始样品的质量应不少于50g；并制成复合样品，每份复合样品的质量 其他方式进境的玉米霜霉病菌寄主种子或原粮，以车、车皮或其包装为单位扦取1份复合样 品，每份复合样品的质量应不少于1500g：少于1500g全部取样检验。其他也按本标准执行。 5.2.2船运散装原粮和种子的取样次数 第一次取样，卸货前在表层进行；第二次取样，卸货三分之一时进行；第三次取样，卸货三 分之二时进行。每次取样各制备复合样品1份。 5.2.3一般包装玉米霜霉病菌寄主种子或原粮的取样份数和重量 5.2.3.1取样份数 10kg以下取1份；11kg～100kg取2份；101kg～500kg取3份；501kg～1000kg取4份 1001kg～2000kg以下取5份；2001kg～5000kg取6份；5001kg～10000kg取7份；10 001kg以上，每增加10000kg增取1份样品，不足10000kg的余量，计取1份样品。 5.2.3.2取样重量