蚕豆染色病毒血清学检测方法 Serological detection method of broad bean stain comovirus SN/T 1139—2002 前言 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、南京农业大学。本标准主要起草 人：陶庭典、许志刚、易建平、印丽萍、杨翠云。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 1范围 本标准规定了蚕豆染色病毒的DAS-ELISA检测方法。 本标准适用于蚕豆种子、种苗及其他相关作物中蚕豆染色病毒的检测。检测蚕豆及其他作物 种子内的病毒时，其种子须经发芽或种植并形成小苗后再进行检测。 2缩略语 以下缩略语适用于本标准。 DAS-ELISA双抗体夹心酶联免疫吸附分析法 PBS磷酸缓冲液 10XPBS10倍浓度的PBS母液，用来快速配制PBS缓冲液 PBST含吐温一20的PBS SEB样品抽提液 IgG指纯化的蚕豆染色病毒抗体IgC Coating一IgG指用于包被酶联板的蚕豆染色病毒的抗体IgG IgG-conjugate指用碱性磷酸酶标记过的蚕豆染色病毒的抗体IgG CB包被缓冲液 3方法提要及其依据 蚕豆染色病毒是L1oyd等于1965年在英国的蚕豆上发现的。它是一种直径约28nm的球状病 毒。主要分布在非洲和欧亚地区。蚕豆染色病毒属于豇豆花叶病毒科（Comoviridae）、豇豆花 叶病毒属（Comovirus）。蚕豆染色病毒具有中等强度的免疫源性，产生的抗体可以用作各种血 清学反应。感病叶片汁液中含有较多的病毒粒体，可以通过血清学反应进行检测。血清学方法中 的DAS一ELISA是一种稳定性好、特异性强的方法，本标准采用被国内外广泛使用的DAS-ELISA方 法检测蚕豆染色病毒。 4仪器设备 4.1酶联板。 4.312孔道200μL可调式移液器及吸头。 4.4酸度计。 4.5调温水浴锅或调温培养箱。 4.6ELISA洗板机（不是本标准所要求的）。 4.7酶标仪。 4.8微量样品榨汁机（无微量样品榨汁机时，用研钵进行手工研磨制样）。 4.9量筒（10mL、20mL、50mL、100mL、500mL、1000mL各一个）。 4.10分析天平：精度1/10000g。 4.11试剂瓶（10mL、50mL、100mL、500mL、1000mL各两个）。 4.12封口膜。 4.13吸水纸。 5试剂、溶液及生物制剂 本标准中所有化学试剂的纯度除特别说明外均为分析纯。 行业标准信息服务平台 5.110×PBS的配制 a）81.8g氧化钠； b）1.49g氯化钾； c）2.72g磷酸二氢钾; d）14.2g磷酸氢二钠（Na,HPO42H,0)； e）加水定容至1L。 5.2PBS的配制 a)100 mL 10XPBS; b）850mL水； c）调节pH至7.4后再用水定容至1L。 5.3PBST的配制 在PBS中加入Tween一20，使Tween一20的浓度为0.1%。 5.4SEB的配制 在PBS中加入以下试剂配制SEB a）聚乙烯吡咯烷酮（使其终浓度为2%）； b）卵白蛋白（使其终浓度为0.2%）； c）Tween一20（使其终浓度为0.05%）； d）NaN，（使其终浓度为0.05%）。 5.5CB的配制 a）1.59g碳酸钠； b）2.94g碳酸氢钠， c）0.50g叠氮化钠； d)900 mL水; e）调节pH至9.6后再用水定容至1L。 5.6ELISA底物的配制 用10%二乙醇胺溶液将对硝基苯磷酸配制成1mg/mL的浓度（现配现用）。 5.7包被用IgG 纯化的蚕豆染色病毒抗体IgG，使用国内外正式注册的商品，根据供应商的要求用SEB稀释为 工作浓度。 5.8 IgG-conjugate 碱性磷酸酶标记的蚕豆染色病毒抗体，使用国内外正式注册的商品，用SEB稀释为工作浓 度。 6样品 6.1阳性对照样品：蚕豆染色病毒的纯病毒或者病组织，由抗血清供应商提供，用SEB制备。 6.2阴性对照样品：由抗血清供应商提供，用SEB制备。 6.3空白对照：SEB作空白对照。 6.4待测样品的制备