松材线虫检疫鉴定方法 Methods for quarantine and identification of Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Buhrer) Nickle SN/T 1132—2002 前言 本标准的附录A、附录B为规范性附录，附录C、附录D均为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：沈培垠、徐培方、周弘、刁彩华。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 1 范围 本标准规范了松材线虫检疫鉴定方法和依据。 本标准适用于口岸植物检疫过程中鉴定松材线虫。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2. 1 松材线虫pinewoodnematode，PwN 一种线形动物，隶属于动物界、线虫门（Nematoda）、侧尾腺纲（Secernentea）、垫刃目 （Tylenchida）、滑刃科（Apelenchoidoidea）、伞滑刃属（Bursaphelenchus）。能引起松树菱病，是针叶 树木上最重要的病原生物之一 2. 2 松材线虫为扩散和度过不良生存环境，在寄主组织中出现的一种特定类型的3龄幼虫。 息服务平 2. 3 松材线虫为扩散传播，适应不良环境，在媒介天牛和寄主组织中出现的一种特定类型的4龄幼虫。 2. 4 繁殖型3、4龄幼虫 propagative larva 3andpropagative larva4,LgL4 松材线虫正常生长和繁殖期出现的幼虫虫态。 2. 5 雌虫早期youngfemale 4龄幼虫刚完成蜕皮阶段而出现的早期松材线虫雌虫，具体表现为生殖系统发育尚未完全。 3检疫原理 松材线虫分布在被感染寄主的树体组织中，利用其在水中的活动性和密度大于水的特性，可以将寄 主组织破碎后浸泡在水中，使松材线虫从寄主组织中游离到水中，从而分离和获得松材线虫。 利用甘油置换松材线虫体内的水，可以使松材线虫标本能保存较长时间，从而方便对标本进一步鉴 定。 依据松材线虫成虫头部、食道的形态特征、雌虫的阴门、尾端和雄虫交合刺、交合伞形状等稳定遗 传的形态特征以及体长、体长／体宽比值等测计值，鉴定松材线虫。 4仪器及用具 4.1木工锯或电锯木工钻； 4.2样品袋； 4.3贝尔曼漏斗； 4.4浅盘（筛盘、底盘）； 4.5改进型漏斗分离器； 4.6标准套筛（40目、400目、500目）； 4.7显微镜（放大倍率40×～1000×，具目镜测微尺、绘图仪等）； 4.8体视显微镜（放大倍率10X80×，具透射光源）； 行业标准信息服务平台 4.9超净工作台； 4.10恒温培养箱； 4.11恒温烘箱； 4.12钟面(7cm，β9cm); 4.13培养皿l(7cm，p9cm); 4.14酒精灯； 4.15盖玻片； 4.16载玻片； 4.17线虫挑针； 4.18控温电热平板。 5药品和材料 5.1指甲油 5.20.1%硫酸链霉素（配方见附录A中A.6)； 5.3TAF双倍液（配方见附录A中A.1) 5.4棉蓝-乳酚油（配方见附录A中A.2）； 5.5福尔马林甘油液（配方见附录A中A.3)； 5.6封片蜡（配方见附录A中A.4)； 5.7PDA培养基（配方见附录A中A.5)； 5.8灰葡萄孢菌（Botrytiscinerea)。 6现场检疫 6.1直观检验 对应施检疫物观察材质是否干燥，木质部有否蓝变，有无媒介昆虫栖居的痕迹，如侵入孔、蛀道、 蛹室等。 6.2抽样和取样 6.2.1选取材质干燥无松脂香味、有蓝变、有媒介昆虫栖居痕迹的松木或其加工制品，若无上述特征时 可随机抽样。抽样数量为每批总件数的0.5%～5%，最低不得少于三件，不满三件时全部抽取。 6.2.2将所抽的样木锯成5cm左右的木段，或用木工钻多点钻取木屑（不得少于10g/份），标号后即送 样至实验室检验。 6.2.3取样时注意选取靠近虫道、蛹室的部位，钻取木屑时要注意先把取样部位的树皮剥净。 6.2.4必要时可将样木整件带回实验室检验。 行业标准信息 7实验室检验 7.1松材线虫的分离 松材线虫分离方法见附录B。 7.2线虫的镜检 在体视显微镜下观察钟面血中收集的线虫分离液，发现线虫后用挑针挑取或用50gL微量移液器吸取 服务 线虫并制成临时水玻片，在显微镜下观察。 7.2.1临时水玻片的制作 在载玻片上滴加一小滴水液（约50μL），将线虫挑至水滴中央，沉底。从水滴正上方加盖玻片，在酒 精灯上用1s的振幅周期通过10次左右，使线虫恰好被杀死。 7.2.2每份样品的分离液中线虫含量在20条以下的，全部制成临时水玻片境检；20条以上时，通过解剖 镜观察选取各类各虫态线虫制片镜检，每类每虫态线虫至少镜检三条以上。 7.3松材线虫的培养