ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 772—2004 禽流感病毒RT-PCR试验方法 行业标准信息服务平台 2004-02-17发布 2004-02-17实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 772—2004 前言 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准推荐了两种试验方法。 本标准中附录A、附录C为规范性附录，附录B、附录D为资料性附录。 本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、农业部兽医诊断中心。 本标准主要起草人：王秀荣、孙明、刘明、王宏伟、陈化兰、刘丽玲。 行业标准信息服务平 I NY/T 772—2004 禽流感病毒RT一PCR试验方法（一） 1范围 本标准规定了禽流感病毒型特异性检测技术和禽流感病毒 H5、H7、H9血凝素亚型及 N1、N2神经 氨酸酶亚型的RT-PCR鉴别技术。 本标准适用于检测禽组织、分泌物、排泄物和鸡胚尿囊液中禽流感病毒核酸。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是 否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 18936 高致病性禽流感诊断技术 3实验室条件 移液器、水浴箱等。 3.2从事RT-PCR工作的实验室尽可能分区，根据条件划分出RNA提取区、基因扩增区、电泳区。 特别注意电泳后的琼脂糖凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。 3.3注意个人防护和环境保护，电泳中用到的EB可诱发基因突变，试验中被EB污染的物品要有专用 收集处，并通过焚烧进行无害化处理。 4试剂的准备 4.1试剂 4.1.1变性液见A.1。 4.1.22M醋酸钠溶液(pH4.0)见A.2。 4.1.3水饱和酚(pH4.0)。 4.1.4氯仿/异戊醇混合液见A.3。 4.1.5 M-MLV反转录酶(200u/μL)。 4.1.6RNA酶抑制剂(40u/μL)。 4.1.7 Taq DNA 聚合酶(5 u/μL)。 4.1.950×TAE缓冲液见A.5。 4.1.10溴化乙锭(10μg/μL)见A.6。 4.1.11加样缓冲液见A.7。 4.1.12焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水见A.8。 4.1.135×反转录反应缓冲液见A.9。 4.1.14 2.5 mmol dNTPs 见 A.10。 4.1.15 10×PCR Buffer 见 A.11。 1