ICS 11. 220 NY B 41 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 679--2003 猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法 Enzyme immunoassay for porcine reproductive and respiratory syndrome 行业标准信息服务平 2003-10-01实施 2003-07-30发布 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 679-2003 前言 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。 本标准起草单位：农业部兽医诊断中心。 本标准主要起草人：王宏伟、王传彬、陈西钊、田克恭。 行业标准信息服务平 NY/T 679—2003 猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法 1 范围 本标准规定了猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)免疫酶试验和免疫酶组织化学方法。 本标准适用于检测猪血清中的猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)抗体和组织中的PRRSV抗原。 2 免疫酶试验 2.1材料准备 2.1.1试剂 2.1.1.1磷酸盐缓冲液(PBS)：配制见第A.1章。 2.1.1.2抗原涂片的制备：PRRSV接种于生长至70%～80%单层的Marc-145细胞。接种后3d~～ 4d，病变达50%～75%时，用胰蛋白酶消化分散感染的细胞单层，PBS洗涤三次后，稀释至1×106个细 胞/mL。取印有10个～40个小孔的室玻片，每孔滴加10μL。室温自然干燥后，冷丙酮（4℃）固定 10min。密封包装，置一20℃备用。 2.1.1.3标准阳性血清：PRRSV试验感染猪制备的血清。 2.1.1.4标准阴性血清：无PRRSV感染、未经免疫的猪血清。 2.1.1.5酶结合物：辣根过氧化物酶(HRP)标记的葡萄球菌A蛋白(SPA)。 2.1.1.6底物溶液：配制见第A.2章。 2.1.2器材 a） 普通光学显微镜； b) 印有10个～40个小孔的室玻片； 微量加样器，容量5μL～50μL； 37℃恒温培养箱或水浴箱。 d) 2.1.3样品 采集被检猪血液，分离血清。血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或一30℃ 保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用PBS作10倍稀释。 2.2操作方法 2.2.1取出抗原涂片，室温干燥后，滴加10倍稀释的待检血清和标准阴性血清、标准阳性血清，每份血 清加两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔，置湿盒内，37℃30min。 2.2.2PBS漂洗三次，每次5min，室温干燥。 2.2.3滴加适当稀释的酶结合物，置湿盒内，37℃30min。 2.2.4PBS漂洗三次，每次5 min。 2.2.5将室玻片放人底物溶液中，室温下显色5min～10min。PBS漂洗两次，再用蒸馏水漂洗一次。 2.2.6吹干后，在普通光学显微镜下观察，判定结果。 2.3结果判定 无色；阳性血清与正常细胞反应无色，与病毒感染细胞反应呈棕黄色至棕褐色，即可判定结果；否则应 重试。 2.3.2待检血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均呈无色，即可判为PRRSV抗体阴性。 2.3.3待检血清与正常细胞反应呈无色，而与病毒感染细胞反应呈棕黄色至棕褐色，即可判为 1