ICS 11. 220 NY B 41 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 678—2003 猪伪狂犬病免疫酶试验方法 Enzyme immunoassay for porcine pseudorabies 行业标准信息服务平 2003-07-30发布 2003-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 678—2003 前言 本标准的附录 A是规范性附录。 本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。 本标准起草单位：农业部兽医诊断中心。 本标准主要起草人：王宏伟、吴清民、童光志、田克恭、陈西钊、苏敬良、王传彬。 行业标准信息服务平 一台 NY/T 678—2003 猪伪狂犬病免疫酶试验方法 1 范围 本标准规定了猪伪狂犬病E糖蛋白(gE,即 gp I)酶联免疫吸附试验和免疫酶组织化学试验方法。 本标准适用于检测猪血清中的猪伪狂犬病病毒 gE特异性抗体和组织中的猪伪狂犬病病毒抗原。 2 E糖蛋白酶联免疫吸附试验(gE-ELISA) 2.1材料准备 2. 1. 1 试剂 ELISA抗原包被板； b) 标准阳性血清：伪狂犬病病毒gE单克隆抗体； 标准阴性血清:无伪狂犬病病毒gE抗体的猪血清； c) 酶结合物：辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗伪狂犬病病毒gE单克隆抗体； e) 磷酸盐缓冲液(PBS)：配制见第A.1章； 洗涤液：配制见第A.2章； 样品稀释液：配制见第A.3章； g) h) 底物溶液：配制见第A.5章； i) 终止液：配制见第A.6章。 2. 1. 2 器材 a) 酶联检测仪； b) 微量加样器，容量50μL～200μL； 37℃恒温培养箱。 2.1.3样品 采集被检猪血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或一30℃保 存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用样品稀释液作2倍稀释。 2.2操作方法 2.2.1取出包被板，并将样品位置准确记录在记录单上。 2.2.2向A1、A2、A：孔中分别加入100μL未经稀释的阴性对照血清，A4、As、A。孔中分别加人 100μL未经稀释的阳性对照血清，其他各孔加人100μL稀释好的待检样品。 2.2.3置室温1 h。 2.2.4弃去孔内液体，再在纱布或吸水纸上拍干。 2.2.5用洗涤液将反应板洗涤(3～5)次，每次洗涤后均弃去孔内液体。最后次洗涤后，除净孔内液 体,拍干。 2.2.6每孔加人100μL酶结合物溶液，室温下作用20min。 2.2.7重复2.2.4和2.2.5。 2.2.8，各孔加人100μL底物液。 2.2. 9 室温放置15min。 2.2.10各孔加人50μL终止液，立即用酶标仪于650nm测定各孔吸光度（OD)值。 2.3结果判定 2.3.1只有在阴性对照OD值的均值减去阳性对照OD值的均值大于等于0.3时，试验成立。 1