ICS 11. 22U B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 543—2002 牛流行热微量中和试验方法 Micro-neutralization test for bovine ephemeral fever 行业标准信息服务平台 2002-08-27发布 2002-12-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 543-2002 前言 牛流行热（简称BEF)又称牛暂时热、三日热、一日热、僵硬病等，本病在亚、非和大洋洲许多国家均 有发生。该病是由弹状病毒科暂时热病毒属牛流行热病毒引起的一种急性、热性传染病，呈周期性流行。 在发病期间，对牛的产奶量、使役能力、增重、精液品质都有严重影响，还可导致少数病牛瘫痪，流产甚至 死亡。严重危害养牛业的发展。 本标准是根据我国科研成果，与澳大利亚合作研究成果和我国的实践经验制定的。 本标准的附录 A、附录 B、附录 C为规范性附录,附录 D为资料性附录。 本标准由农业部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。 本标准主要起草人：白文彬、严隽端。 行业标准信息服务平 NY/T 543--2002 牛流行热微量中和试验方法 1 范围 本标准规定了牛流行热微量血清中和试验技术。 本标准适用于牛流行热的诊断、免疫监测和流行病学调查。 2 微量血清中和试验 2.1″器材 2.1.1营养液和0.05%胰酶EDTA(简称ATV)液，配制方法见附录A。 2.1.2细胞及其制备、传代、计数方法，见附录B。 2.1.3抗原（指示毒）、标准阳性血清、阴性血清由法定单位提供，按说明书使用。抗原毒价以及工作抗 原(100TCIDso)测定方法见附录C。 .2.1.4微量滴定板：无菌带盖96孔微量滴定板（简称微量板）。 2.1.5微量加样器：25μL、50μL及100μL单道和多道加样器，加样塑料滴头（装量为25μL～ 100 μL，与加样器配套使用）。， 2.1.6二氧化碳培养箱。 2.2操作方法 2.2.1灭活 被检血清以及阴、阳性血清用前均于56℃水浴锅中灭活30 min。 2.2.2准备 制备工作抗原（指示毒）方法（见第C.1章），将已知毒价的合格种毒用生长液（见第A.1章）稀释成 100 TCID50/mL. 2.2.3定性试验 2.2.3.1向微量板的每孔各加25uL生长液。 2.2.3.2在第-排加被检血清，每份占2孔，每孔25μL，混合均匀，即成2倍稀释。 2.2.3.3用多道加样器从第1孔取25μL液体对应移人第2排孔内，混匀即成4倍稀释。再从孔内吸 出25μL丢弃。 2.2.3.4每孔加工作抗原25μL，混匀置37℃孵育60min。 2.2.3.5每孔加细胞悬液100μL(30000个细胞）。细胞计数方法见第B.3章。 2.2.3.6试验对照系统的设置。每批试验的对照系统的设置：标准阳性血清，从第1列至第6列,每列 4 孔,逐列稀释(即 2 倍～64 倍),标准阴性血清、细胞对照和病毒对照各 1 列 4 孔。同时对本试验使用的 工作抗原，随同试验再次进行测定。 2.2.3.7用灭菌的盖子盖上微量板，置37℃二氧化碳(CO,)培养箱内，培养5d。从第3d起逐日记录 细胞病变效应(CPE)。 2.2.3.8结果判定：标准阳性血清中和抗体价≥64,标准阴性血清,病毒对照排各孔均出现CPE,工作 抗原含量滴定在规定的范围之内（CPE出现的孔数与毒价查阅方法见第D.1章），细胞对照孔正常情况 下，4倍稀释的被检血清列，两孔都出现CPE时，判为阴性；仅1孔出现CPE，被判为可疑，应再重复试 验一次；两孔均不产生 CPE时,则被判为阳性。 1