ICS_ 11. 220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 549--2002 赤羽病细胞微量中和试验方法 Cells microneutralization test for akabane disease 行业标准信息服务平 2002-08- 27 发布 2002-12-01实施 中华人民共和国农业部 5发布 NY/T 549—2002 前言 赤羽病(akabane disease，又名阿卡斑病)是由赤羽病病毒(akabane disease virus)引起的牛、绵羊和 山羊的一种多型性传染病。该病以流产、早产、死胎、畸形产为特征，能引起先天性关节弯曲和积水性无 脑症。 本病的病原是赤羽病病毒,属布尼病毒科布尼病毒属,病毒表面有两种糖蛋白(G1 和G),它们分别 诱导中和抗体和血凝抑制抗体产生。本病的血清学诊断方法为细胞微量中和试验。 本标准由农业部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 ·本标准起草单位：农业部动物检疫所。 本标准主要起草人：周立桥、李昌琳、封启民、李其平。 行业标准信息服务平 NY/T 549—2002 赤羽病细胞微量中和试验方法 1范围 本标准规定了赤羽病(akabane disease)细胞微量中和试验技术要求。 本标准适用于牛、羊赤羽病感染的定性以及免疫群体抗体水平的评估。 2材料准备 2.196孔细胞培养物，移液器（50μL、200μL)滴头，无毒透明塑料胶带，小试管。 2.2Vero细胞或SVP细胞。 2.3抗原、标准阳性血清、标准阴性血清。 2.4被检血清，无菌采集，不加防腐剂。 3操作方法 3.1准备 3.1.1取一支已知滴度的赤羽病病毒（AKV),用199细胞培养液稀释成100TCID5/50μL，作为工作 浓度抗原。 3.1.2被检血清、标准阳性血清、标准阴性血清均56℃灭活30min，用199液做1：4稀释（即50μL 血清加入150μL199液中） 3.1.3按常规微量中和试验法每个样品接种4孔，每孔分别加被检稀释血清和工作浓度抗原各50μL， 轻轻振荡培养板使抗原与稀释血清充分混合，将培养板加盖置37℃培养箱内中和1h。 3.1.4每孔滴加SVP细胞或Vero细胞悬液（20万/mL)100μL，用透明塑料胶带封板，置37℃温箱内 培养，用倒置显微镜观察细胞病变情况（通常72h内引起细胞病变）。 3.2对照设置 每次试验均要设置标准阳性、阴性血清对照、病毒对照、正常细胞对照和抗原实际用量的回归滴度 对照。 3.2.1标准阳性、阴性血清对照，将已稀释好的标准阳性、阴性血清分别加人培养板4孔内，每孔 50μL，然后各孔加人工作浓度抗原50μL。 3.2.2病毒对照：将工作浓度抗原滴加培养板4孔内，每孔50μL，补加细胞生长液50μL。 3.2.3将以上三种对照置37℃温箱内1h，然后于各孔内加人100μL细胞悬液，置37℃温箱内培养， 72h后在倒置显微镜下观察结果。 3.2.4正常细胞对照：于培养板4孔内各加100μL细胞悬液，然后再于各孔补加细胞生长液100μL。 3.2.5抗原实际用量的回归滴度的测定：在每次试验中，应对使用的100TCID50/50μL抗原进行实际 胞生长液50μL，置37℃温箱内1h，然后每孔加入100μL细胞悬液，计算该试验中TCID5o/50μL的实 际用量。 4结果判定 4.1将培养板放置37℃温箱内培养72h进行初判，120h进行终判。在倒置显微镜下检查细胞病变